Polifenollerle kombine edilmiş Lycium barbarum için alkali hidroliz ve asit hidroliz ekstraksiyon işlemlerinin karşılaştırılması ve ürün analizi
Fenolik maddeler, flavonoidler, flavonoidler, antosiyaninler, kateşinler vb. dahil olmak üzere bitkiler aleminde yaygın olarak dağılır ve bitkilerde en bol bulunan ikincil metabolitlerden biridir. Güçlü antioksidan özellikleri ve antioksidan, anti-enflamatuar, anti-tümör, hipotansif, hipoglisemik ve lipid düşürücü etkileri gibi çeşitli oksidatif stresle ilişkili hastalıkların önlenmesindeki önemli etkileri nedeniyle, gıda ve doğal/geleneksel Çin tıbbındaki fenolik maddeler giderek daha fazla ilgi görmektedir. Bitkilerde fenoller, çözücülerle ekstrakte edilebilen çözünebilir fenolik maddeler ve çözücülerle doğrudan ekstrakte edilemeyen ekstrakte edilemeyen fenolik bileşikler (NEPC) olmak üzere hem serbest hem de bağlı formlarda bulunur. Sonuncusu, ester bağları ve glikosidik bağlar gibi kovalent bağlar yoluyla şekerler, hemiselüloz, pektin ve proteinler gibi makromoleküllere bağlanır ve bitkilerdeki fenolik bileşenlerin ana formudur. Gıdalardaki fenolik maddeler üzerine yapılan araştırmalar, NEPC'nin serbest fenolik maddelerden daha iyi biyolojik aktivite sergilediğini ortaya koymuştur. Örneğin, serbest fenollerle karşılaştırıldığında, tahıllardaki NEPC daha yüksek peroksit radikal süpürme kabiliyeti ve hücresel antioksidan aktivite gösterir. Genellikle bitkilerdeki fenolik maddelerin biyolojik aktivitesinin biyoyararlanımlarıyla yakından ilişkili olduğuna inanılır. İlaç metabolizması üzerine yapılan araştırmalar, serbest fenollerin sindirim suları tarafından parçalanabildiğini, NEPC'nin ise büyük moleküllerle ilişkisi nedeniyle sindirilmediğini ortaya koymuştur. Bağırsağa girdikten sonra, biyolojik aktivite göstermek için bağırsak mikrobiyotası tarafından hidrolize edilir ve hatta sürekli salım formülasyonlarına benzer etkiler gösterir. Buna ek olarak, bazı NEPC'ler insan vücudunu etkileyen diğer bileşiklere dönüştürülebilir. Bu nedenle, gıda ve doğal/geleneksel Çin tıbbındaki NEPC'nin derinlemesine analizi, fenolik maddelerin biyolojik aktivitesinin kapsamlı bir şekilde değerlendirilmesine yardımcı olabilir.
Lycium barbarum L., Solanaceae familyasından bir bitki olan Lycium barbarum L.'nin kurutulmuş ve olgunlaşmış meyvesidir. Modern farmakolojik çalışmalar, Lycium barbarum'un, çoğu Lycium barbarum polisakkaritlerinin ve fenolik bileşiklerinin sinerjik etkisi olan antioksidan aktivite ile ilgili olan çok sayıda potansiyel biyolojik aktiviteye sahip olduğunu göstermiştir. Araştırma grubumuz önceki çalışmalarında, Lycium barbarum polisakkaritlerinin alkali hidroliz ürünlerinde gallik asit ve ferulik asidin tespit edilebildiğini ve bunun da NEPC'nin varlığını gösterdiğini bulmuştur. İlgili analiz sonuçları, Lycium barbarum'daki NEPC'nin antioksidan aktivitesinde önemli bir rol oynadığını göstermektedir. Şu anda, goji meyvelerindeki fenolik bileşikler üzerine yapılan araştırmalar çoğunlukla çözünür fenollere odaklanmaktadır. NEPC'nin ihmal edilmesi, goji meyvelerindeki fenolik bileşiklerin toplam içeriğini, antioksidan kapasitesini ve insan sağlığı üzerindeki olumlu etkisini hafife alabilir.
NEPC'yi analiz etmek için öncelikle ester ve glikozidik bağları kırmak ve fenolik bileşenleri serbest bırakmak için uygun hidroliz yöntemleri kullanılmalıdır. Şu anda literatürde en yaygın kullanılan hidroliz yöntemleri asit hidrolizi ve alkalin hidrolizidir. Çalışmaların yaklaşık 30%'si NEPC ve makromoleküller arasındaki kovalent bağları hidrolize etmek için asit (genellikle hidroklorik asit veya sülfürik asit) kullanmaktadır. Alkali hidroliz ile karşılaştırıldığında, asit hidrolizi daha fazla fenolik bileşeni serbest bırakabilir, ancak asit hidrolizi için gerekli olan yüksek sıcaklık, yüksek asitlik koşulları ve uzun süreli hidroliz genellikle fenolik bileşenlerin bozulmasına yol açabilir. Ferulik asit gibi bitkilerdeki yaygın fenolik bileşikler genellikle ester bağları yoluyla hücre duvarlarına bağlanır. Çoğu çalışma, bitkilerdeki NEPC'yi analiz etmek için alkali hidroliz kullanır. NEPC'yi sodyum hidroksit gibi inorganik bazlarla hidrolize ederken, yüksek sıcaklıklar gerekli değildir, ancak fenolik bileşenlerin bozulmasını önlemek için reaksiyonun genellikle azot koruması altında ışık yokluğunda gerçekleştirilmesi gerekir.
Goji meyvelerindeki fenolik bileşenleri kapsamlı bir şekilde değerlendirmek amacıyla, bu çalışmada goji meyvelerinden serbest fenolik bileşenleri çıkarmak için asit hidrolizi ve alkali hidrolizi kullanılmıştır. Fenolik bileşenlerin verimi değerlendirme indeksi olarak kullanılmış ve asit-baz konsantrasyonu, hidroliz süresi ve katı-sıvı oranının değerlendirme indeksi üzerindeki etkilerini değerlendirmek için tek faktörlü deneyler ve yanıt yüzeyi metodolojisi kullanılmıştır. Alkali hidroliz ve asit hidroliz için proses koşulları optimize edildi; ve UPLC-Q-TOF-MS, farklı hidroliz yöntemleriyle elde edilen numunelerdeki fenolik bileşenleri karşılaştırmak için kullanıldı ve farklı fenolik bileşenler için uygun hidroliz yöntemlerinin seçilmesi için referans sağladı.

 

Fenolik bileşikler, bitkilerde en bol bulunan ikincil metabolitler ve aynı zamanda en çok ilgilenilen biyoaktif maddelerden biridir. Bitkilerdeki fenolik bileşikler hem serbest hem de bağlı formlarda bulunur ve NEPC bitkilerdeki fenolik maddelerin ana bileşenidir. Önceki çalışmaların çoğu serbest fenollerin bileşimine ve biyolojik aktivitesine odaklanmış, NEPC'ye daha az ilgi gösterilmiştir. Günümüzde, giderek artan sayıda çalışma NEPC'nin gıda ve doğal/geleneksel Çin tıbbında önemli bir aktif madde olabileceğini göstermektedir. Benzer şekilde, goji meyvelerindeki serbest fenolik bileşenler üzerine yapılan araştırmalar çok derinlemesine olmuştur, ancak NEPC ile ilgili herhangi bir rapor bulunmamaktadır. Araştırma ekibinin ön araştırması, Lycium barbarum polisakkaritlerinin fenolik maddeler elde etmek için zayıf sodyum hidroksit (0.2mol/L) ile hidrolize edilebileceğini ve bunun da ester bağları ile bağlı fenolik maddelerin olası varlığını gösterdiğini ortaya koymuştur. Genel olarak NEPC'nin selüloz, proteinler ve lignin gibi makromoleküllerle kovalent bağ şeklinde etkileşime girdiğine veya iyonik bağlar veya fiziksel etkileşimler yoluyla bitki liflerine bağlandığına veya hücrelere gömüldüğüne inanılmaktadır. Goji meyvelerindeki NEPC, polisakkaritlere veya bitki substratlarına bağlıdır ve daha fazla doğrulamaya ihtiyaç vardır.
NEPC, su veya alkol çözücüleri kullanılarak doğrudan ekstrakte edilemez. Goji meyvelerindeki NEPC'yi analiz etmek için, NEPC hazırlamak üzere alkali hidroliz veya asit hidroliz yöntemleri kullanılmalıdır. Alkali, fenolik bileşenler ile şekerler, proteinler, pektin, lifler vb. maddeler arasındaki ester bağlarını kırabilir, böylece fenolleri serbest bırakır ve tespit edilebilir. Sodyum hidroksit en yaygın kullanılan alkali hidroliz bileşiğidir. Alkali hidroliz işlemi sırasında, fenolik bileşenler genellikle oksijen, yüksek sıcaklık ve ışık gibi koşullar altında bozunmaya uğrar. Bu nedenle, genellikle azot koruması altında ışık yokluğunda düşük sıcaklıklarda hidrolize edilirler. Bu çalışmada da hidroliz katalizörü olarak sodyum hidroksit kullanılarak azot koruması altında düşük sıcaklıkta hidroliz gerçekleştirilmiştir. Asit hidrolizinde genellikle hidroklorik asit gibi güçlü asitler kullanılır. Hidroklorik asit sadece ester bağlarını hidrolize etmekle kalmaz, aynı zamanda glikozidik bağları da hidrolize ederek NEPC'nin monomerlerini veya oligomerlerini etkili bir şekilde serbest bırakır. Bu çalışmada, alkali hidroliz ile ölçülen goji meyvelerindeki NEPC 0.65 ± 0.05mg/100g iken, asit hidroliz ürünlerinde 0.52 ± 0.03mg/100g olarak bulunmuştur. İkisi arasındaki fark, asit hidrolizi ve alkali hidrolizinin farklı mekanizmalarından kaynaklanıyor olabilir. Hem tek faktörlü deneyler hem de yanıt yüzeyi deneyleri, alkali hidroliz için gereken optimum sürenin asit hidroliz ile aynı olduğunu göstermiştir. Bununla birlikte, alkali hidrolizle hazırlanan NEPC'nin verimi daha yüksekti; bunun nedeni alkali hidrolizin NEPC'nin yapısal proteinler, diyet lifi vb. ile bağlanmasını daha fazla kesintiye uğratması olabilir. Asit işlemi glikozidik bağları kırar ve şekerleri çözer. Asidik koşullar altında, polifenol moleküllerindeki hidroksil grupları kolayca protonlanarak polifenol moleküllerinin kırılmasına ve monomer veya oligomerlerin serbest kalmasına neden olur. Yüksek sıcaklıklarda asidik hidroliz, bazı fenolik maddelerin kaybına neden olabilir; Alkali koşullar altında, polifenol moleküllerindeki hidroksil grupları, asit hidroliz koşullarına göre daha kolay deprotonlanır, bu da biraz daha yüksek alkali hidroliz verimi ve daha az kayıpla sonuçlanır.
Önceki çalışmalar, alkali hidroliz ve asit hidroliz yoluyla elde edilen NEPC'de farklılıklar bulmuştur. Kafeik asit, kateşinler ve gallik asit türevleri unun asit hidroliz ürünlerinde tespit edilebilirken, ferulik asit sadece alkali hidroliz ürünlerinde mevcuttur, bu da asit hidrolizinden elde edilen daha fazla fenolik madde türü olabileceğini göstermektedir. Bu çalışmada, goji meyvelerinin NEPC hidroliz ürünlerindeki maddelerin bileşimini analiz etmek için UPLC-Q-TOF-MS kullanılmıştır. Toplam iyon kromatogramı (bkz. Şekil 6), alkali hidroliz ve asit hidroliz ürünleri arasındaki bileşik türlerinde bir fark olmadığını, ancak asit hidroliz ürünlerinin sayısının alkali hidroliz ürünlerinden önemli ölçüde daha yüksek olduğunu göstermiştir. Bu fenomen, fenolik hidroksil gruplarının güçlü alkali ortamlarda kolay deprotonasyonu ve yok edilmesinden kaynaklanıyor olabilir, bu da onları kütle spektrometresi ile tespit edilemez hale getirirken, fenolik maddeler asidik ortamlarda daha kararlı ve tespit edilmesi daha kolaydır; Öte yandan, alkali hidroliz sadece fenoller ve makromoleküller arasındaki ester bağlarını kırabilirken, asitler sadece ester bağlarını değil aynı zamanda glikozidik bağları da hidrolize edebilir, bu nedenle tespit edilebilecek daha fazla fenolik madde türü vardır. Ürünler açısından bakıldığında, başlıca olanlar fenilpropanoid türevleridir. Tanımlanan 11 bileşik arasında 8 fenilpropanoid, 1 kumarin, 1 fenilpropanoid türevi ve 1 benzofenon bulunmaktadır. Alkali hidroliz ürününde, ana madde ferulik asit olmak üzere sadece dört bileşik tanımlanabilir; Ve tanımlanan 11 bileşiğin tümü asit hidroliz ürünlerinde tespit edilebilir. Bu 8 fenolik asit arasında 2 bileşiğin, goji meyvelerindeki doğal maddeler yerine NEPC'nin hidrolizi sırasında kumarin lakton halkasının açılmasının ürünleri olabileceği dikkat çekmektedir. Bu durum hidroliz sürecinde kullanılan yüksek konsantrasyondaki asitlerle ilgili olabilir. Daha sonraki aşamada, daha eksiksiz bir moleküler yapı elde etmek için asitlerin veya bazların konsantrasyonu azaltılabilir. Ayrıca, goji meyvelerinde bulunan NEPC esas olarak fenilpropanoid asit ve kumarin bileşenlerinden oluşur. Başka bileşenlerin olup olmadığı, hidroliz ürünlerinin daha fazla analiz edilmesini gerektirmektedir. Goji meyvelerinde NEPC'nin derinlemesine analizini yapmak için, kütle spektrometresi tespiti daha sonraki aşamada kılavuz olarak kullanılmalı ve hidroliz sırasında asit / alkali konsantrasyonu, goji meyvelerine ait gerçek doğal NEPC'yi elde etmek için ayarlanmalıdır.