Sammenligning og produktanalyse af ekstraktionsprocesser med alkalisk hydrolyse og syrehydrolyse for Lycium barbarum kombineret med polyfenoler
Fænoliske stoffer er vidt udbredt i planteriget, herunder flavonoider, flavonoider, anthocyaniner, catechiner osv. og er en af de mest almindelige sekundære metabolitter i planter. På grund af de stærke antioxidantegenskaber og betydelige virkninger i forebyggelsen af forskellige oxidative stressrelaterede sygdomme som antioxidant, antiinflammatorisk, antitumor, hypotensiv, hypoglykæmisk og lipidsænkende virkning, får fenoliske stoffer i fødevarer og naturlig/traditionel kinesisk medicin stigende opmærksomhed. I planter findes fenoler i både fri og bundet form, nemlig opløselige fenoliske stoffer, der kan udvindes med opløsningsmidler, og ikke-ekstraherbare fenoliske forbindelser (NEPC), der ikke kan udvindes direkte med opløsningsmidler. Sidstnævnte binder sig til makromolekyler som sukker, hemicellulose, pektin og proteiner gennem kovalente bindinger som esterbindinger og glykosidbindinger og er den vigtigste form for fenoliske komponenter i planter. Forskning i fenoliske stoffer i fødevarer har vist, at NEPC udviser bedre biologisk aktivitet end frie fenoliske stoffer. Sammenlignet med frie fenoler har NEPC i korn f.eks. en højere evne til at fjerne peroxidradikaler og en højere cellulær antioxidantaktivitet. Det antages generelt, at den biologiske aktivitet af fenoliske stoffer i planter er tæt forbundet med deres biotilgængelighed. Forskning i lægemiddelmetabolisme har vist, at frie fenoler kan nedbrydes af fordøjelsessaft, mens NEPC ikke fordøjes på grund af dets tilknytning til store molekyler. Når det kommer ind i tarmen, hydrolyseres det af tarmens mikrobiota for at udøve biologisk aktivitet og endda udvise effekter, der ligner formuleringer med vedvarende frigivelse. Desuden kan nogle NEPC omdannes til andre forbindelser, der påvirker menneskekroppen. Derfor kan en dybdegående analyse af NEPC i fødevarer og naturlig/traditionel kinesisk medicin hjælpe med at evaluere den biologiske aktivitet af fenoliske stoffer.
Lycium barbarum L. er en tørret og moden frugt af Lycium barbarum L., en plante i Solanaceae-familien. Moderne farmakologiske undersøgelser har vist, at Lycium barbarum har flere potentielle biologiske aktiviteter, hvoraf de fleste er relateret til antioxidantaktivitet, som er den synergistiske effekt af Lycium barbarums polysaccharider og phenolforbindelser. Vores forskningsgruppe har i tidligere undersøgelser fundet ud af, at gallussyre og ferulasyre kan påvises i de alkaliske hydrolyseprodukter af Lycium barbarum-polysaccharider, hvilket indikerer tilstedeværelsen af NEPC. Relevante analyseresultater tyder på, at NEPC i Lycium barbarum spiller en vigtig rolle i dets antioxidantaktivitet. På nuværende tidspunkt fokuserer forskningen i fenolforbindelser i gojibær mest på opløselige fenoler. Hvis man ignorerer NEPC, kan man undervurdere det samlede indhold, antioxidantkapaciteten og den positive indvirkning af fenolforbindelser i gojibær på menneskers sundhed.
For at analysere NEPC skal der først anvendes passende hydrolysemetoder til at bryde ester- og glykosidbindinger og frigøre fenoliske komponenter. På nuværende tidspunkt er de mest anvendte hydrolysemetoder i litteraturen syrehydrolyse og alkalisk hydrolyse. Omkring 30% af undersøgelserne bruger syre (normalt saltsyre eller svovlsyre) til at hydrolysere de kovalente bindinger mellem NEPC og makromolekyler. Sammenlignet med alkalisk hydrolyse kan syrehydrolyse frigive flere phenoliske komponenter, men den høje temperatur, høje surhedsgrad og langvarige hydrolyse, der kræves til syrehydrolyse, kan ofte føre til nedbrydning af phenoliske komponenter. Almindelige phenolforbindelser i planter, som f.eks. ferulinsyre, bindes ofte til cellevægge gennem esterbindinger. De fleste undersøgelser bruger alkalisk hydrolyse til at analysere NEPC i planter. Når man hydrolyserer NEPC med uorganiske baser som natriumhydroxid, er det ikke nødvendigt med høje temperaturer, men reaktionen skal ofte udføres i fravær af lys under kvælstofbeskyttelse for at forhindre nedbrydning af fenoliske komponenter.
For at foretage en omfattende evaluering af de phenoliske komponenter i gojibær blev der i denne undersøgelse anvendt syrehydrolyse og alkalihydrolyse til at fjerne frie phenoliske komponenter fra gojibær. Udbyttet af fenoliske komponenter blev brugt som evalueringsindeks, og enkeltfaktoreksperimenter og responsoverflademetode blev brugt til at evaluere virkningerne af syre-base-koncentration, hydrolysetid og forholdet mellem faststof og væske på evalueringsindekset. Procesbetingelserne for alkalihydrolyse og syrehydrolyse blev optimeret; og UPLC-Q-TOF-MS blev brugt til at sammenligne de phenoliske komponenter i prøver opnået ved forskellige hydrolysemetoder, hvilket giver reference til valg af passende hydrolysemetoder til forskellige phenoliske komponenter.

 

Fænoliske forbindelser er de mest udbredte sekundære metabolitter i planter og også et af de mest omtalte bioaktive stoffer. Fænoliske forbindelser i planter findes i både frie og bundne former, hvor NEPC er den vigtigste komponent af fenoliske stoffer i planter. De fleste tidligere undersøgelser har fokuseret på sammensætningen og den biologiske aktivitet af frie fenoler, mens der har været mindre opmærksomhed på NEPC. I øjeblikket tyder et stigende antal undersøgelser på, at NEPC kan være et vigtigt aktivt stof i fødevarer og naturlig/traditionel kinesisk medicin. På samme måde har forskningen i de frie fenoliske komponenter i gojibær været meget dybdegående, men der har ikke været nogen rapporter om NEPC. Forskerholdets foreløbige forskning viste, at Lycium barbarum-polysaccharider kan hydrolyseres med svag natriumhydroxid (0,2 mol/L) for at opnå phenoliske stoffer, hvilket indikerer den mulige tilstedeværelse af phenoliske stoffer, der er forbundet med esterbindinger. Det antages generelt, at NEPC interagerer med makromolekyler som cellulose, proteiner og lignin i en kovalent bindingsform eller binder sig til plantefibre eller indlejres i celler gennem ioniske bindinger eller fysiske interaktioner. NEPC i gojibær er knyttet til polysaccharider eller plantesubstrater, og der er behov for yderligere bekræftelse.
NEPC kan ikke udvindes direkte med vand- eller alkoholopløsningsmidler. For at analysere NEPC i gojibær skal der anvendes alkaliske hydrolyse- eller syrehydrolysemetoder til at fremstille NEPC. Alkali kan bryde esterbindingerne mellem fenoliske komponenter og stoffer som sukker, proteiner, pektin, fibre osv. og derved frigive fenoler og blive detekteret. Natriumhydroxid er den mest almindeligt anvendte alkaliske hydrolyseforbindelse. Under den alkaliske hydrolyseproces nedbrydes fenoliske komponenter ofte under forhold som ilt, høj temperatur og lys. Derfor hydrolyseres de ofte ved lave temperaturer i fravær af lys under nitrogenbeskyttelse. I denne undersøgelse blev hydrolyse ved lav temperatur også udført under kvælstofbeskyttelse ved hjælp af natriumhydroxid som hydrolysekatalysator. Syrehydrolyse bruger normalt stærke syrer som saltsyre. Saltsyre kan ikke kun hydrolysere esterbindinger, men også hydrolysere glykosidbindinger, hvilket effektivt frigiver monomerer eller oligomerer af NEPC. I denne undersøgelse var NEPC i gojibær målt ved alkalisk hydrolyse 0,65 ± 0,05 mg/100 g, mens det var 0,52 ± 0,03 mg/100 g i syrehydrolyseprodukter. Forskellen mellem de to kan skyldes de forskellige mekanismer i syrehydrolyse og alkalisk hydrolyse. Både enkeltfaktoreksperimenter og responsoverfladeeksperimenter viste, at den optimale tid, der kræves til alkalisk hydrolyse, var den samme som for syrehydrolyse. Udbyttet af NEPC fremstillet ved alkalisk hydrolyse var dog højere, hvilket kan skyldes, at alkalisk hydrolyse i højere grad afbrød bindingen af NEPC med strukturelle proteiner, kostfibre osv. Syrebehandling bryder glykosidiske bindinger og opløser sukker. Under sure forhold bliver hydroxylgrupper i polyfenolmolekyler let protoneret, hvilket får polyfenolmolekyler til at gå i stykker og frigive monomerer eller oligomerer. Sur hydrolyse ved høje temperaturer kan resultere i tab af nogle fenoliske stoffer; under alkaliske forhold deprotoneres hydroxylgrupperne i polyfenolmolekyler lettere end under sure hydrolyseforhold, hvilket resulterer i lidt højere alkaliske hydrolyseudbytter og reducerede tab.
Tidligere undersøgelser har fundet forskelle i NEPC opnået gennem alkalisk hydrolyse og syrehydrolyse. Koffeinsyre, catechiner og gallussyrederivater kan påvises i syrehydrolyseprodukterne af mel, mens ferulinsyre kun findes i alkaliske hydrolyseprodukter, hvilket indikerer, at der kan være flere typer fenoliske stoffer opnået fra syrehydrolyse. Denne undersøgelse brugte UPLC-Q-TOF-MS til at analysere sammensætningen af stoffer i NEPC-hydrolyseprodukterne fra gojibær. Det samlede ionkromatogram (se figur 6) viste, at der ikke var nogen forskel i forbindelsestyperne mellem alkalisk hydrolyse og syrehydrolyseprodukter, men antallet af syrehydrolyseprodukter var betydeligt højere end antallet af alkaliske hydrolyseprodukter. Dette fænomen kan skyldes den lette deprotonering og ødelæggelse af phenoliske hydroxylgrupper i stærke alkaliske miljøer, hvilket gør dem uopdagelige ved massespektrometri, mens phenoliske stoffer er mere stabile og lettere at opdage i sure miljøer; På den anden side kan alkalisk hydrolyse kun bryde esterbindingerne mellem phenoler og makromolekyler, mens syrer kan hydrolysere ikke kun esterbindinger, men også glykosidbindinger, så der er flere typer phenoliske stoffer, der kan detekteres. Ud fra et produktperspektiv er de vigtigste phenylpropanoidderivater. Blandt de 11 identificerede forbindelser er der 8 phenylpropanoider, 1 kumarin, 1 phenylpropanoidderivat og 1 benzophenon. I det alkaliske hydrolyseprodukt kan der kun identificeres fire forbindelser, hvor ferulinsyre er det vigtigste stof; og alle 11 identificerede forbindelser kan påvises i syrehydrolyseprodukter. Det er værd at bemærke, at blandt de 8 phenolsyrer kan 2 forbindelser være produkter af coumarinlactonringåbning under hydrolysen af NEPC, snarere end de oprindelige stoffer i gojibær. Det kan hænge sammen med den høje koncentration af syrer, der blev brugt i hydrolyseprocessen. I den senere fase kan koncentrationen af syrer eller baser reduceres for at opnå en mere komplet molekylær struktur. Desuden består NEPC i gojibær hovedsageligt af phenylpropanoidsyre og kumarinkomponenter. Hvorvidt der er andre komponenter, kræver stadig yderligere analyse af hydrolyseprodukterne. For at foretage en dybdegående analyse af NEPC i gojibær bør massespektrometrisk detektion bruges som vejledning i den senere fase, og koncentrationen af syre/alkali under hydrolysen bør justeres for at opnå den ægte indfødte NEPC, der hører til gojibær.