Vergleich und Produktanalyse der Extraktionsverfahren alkalische Hydrolyse und saure Hydrolyse für Lycium barbarum in Kombination mit Polyphenolen
Phenolische Substanzen sind im Pflanzenreich weit verbreitet, darunter Flavonoide, Anthocyane, Catechine usw., und gehören zu den am häufigsten vorkommenden Sekundärmetaboliten in Pflanzen. Aufgrund ihrer starken antioxidativen Eigenschaften und ihrer bedeutenden Wirkung bei der Vorbeugung verschiedener mit oxidativem Stress zusammenhängender Krankheiten, wie z. B. antioxidative, entzündungshemmende, tumorhemmende, blutdrucksenkende, blutzuckersenkende und lipidsenkende Wirkung, finden phenolische Substanzen in Lebensmitteln und in der natürlichen/traditionellen chinesischen Medizin zunehmend Beachtung. In Pflanzen kommen Phenole sowohl in freier als auch in gebundener Form vor, nämlich als lösliche phenolische Substanzen, die mit Lösungsmitteln extrahiert werden können, und als nicht extrahierbare phenolische Verbindungen (NEPC), die nicht direkt mit Lösungsmitteln extrahiert werden können. Letztere binden sich über kovalente Bindungen wie Esterbindungen und glykosidische Bindungen an Makromoleküle wie Zucker, Hemizellulose, Pektin und Proteine und stellen die Hauptform der phenolischen Bestandteile in Pflanzen dar. Forschungen über phenolische Substanzen in Lebensmitteln haben ergeben, dass NEPC eine bessere biologische Aktivität aufweisen als freie phenolische Substanzen. Im Vergleich zu freien Phenolen weisen NEPC in Getreide beispielsweise eine höhere Fähigkeit zum Abfangen von Peroxidradikalen und eine höhere zelluläre antioxidative Aktivität auf. Es wird allgemein angenommen, dass die biologische Aktivität von phenolischen Substanzen in Pflanzen eng mit ihrer Bioverfügbarkeit zusammenhängt. Forschungen zum Arzneimittelstoffwechsel haben ergeben, dass freie Phenole durch Verdauungssäfte abgebaut werden können, während NEPC aufgrund seiner Verbindung mit großen Molekülen nicht verdaut wird. Nachdem sie in den Darm gelangt sind, werden sie von der Darmmikrobiota hydrolysiert, um biologische Aktivität zu entfalten und sogar ähnliche Wirkungen wie Formulierungen mit verzögerter Wirkstofffreisetzung zu zeigen. Darüber hinaus können einige NEPC in andere Verbindungen umgewandelt werden, die den menschlichen Körper beeinflussen. Daher kann eine eingehende Analyse von NEPC in Lebensmitteln und in der natürlichen/traditionellen chinesischen Medizin dazu beitragen, die biologische Aktivität von phenolischen Substanzen umfassend zu bewerten.
Lycium barbarum L. ist eine getrocknete und reife Frucht von Lycium barbarum L., einer Pflanze aus der Familie der Solanaceae. Moderne pharmakologische Studien haben gezeigt, dass Lycium barbarum eine Vielzahl potenzieller biologischer Aktivitäten besitzt, von denen die meisten mit der antioxidativen Aktivität zusammenhängen, die sich aus der synergistischen Wirkung von Lycium barbarum Polysacchariden und phenolischen Verbindungen ergibt. Unsere Forschungsgruppe hat in früheren Studien festgestellt, dass Gallussäure und Ferulasäure in den alkalischen Hydrolyseprodukten von Lycium barbarum-Polysacchariden nachgewiesen werden können, was auf das Vorhandensein von NEPC hinweist. Entsprechende Analyseergebnisse deuten darauf hin, dass NEPC in Lycium barbarum eine wichtige Rolle bei seiner antioxidativen Aktivität spielt. Gegenwärtig konzentriert sich die Forschung über phenolische Verbindungen in Goji-Beeren hauptsächlich auf lösliche Phenole. Die Vernachlässigung der NEPC kann dazu führen, dass der Gesamtgehalt, die antioxidative Kapazität und die positiven Auswirkungen der phenolischen Verbindungen in Goji-Beeren auf die menschliche Gesundheit unterschätzt werden.
Zur Analyse von NEPC sollten zunächst geeignete Hydrolyseverfahren angewandt werden, um Ester- und Glykosidbindungen aufzubrechen und phenolische Bestandteile freizusetzen. Die derzeit in der Literatur am häufigsten verwendeten Hydrolyseverfahren sind die Säurehydrolyse und die alkalische Hydrolyse. Etwa 30% der Studien verwenden Säure (in der Regel Salzsäure oder Schwefelsäure) zur Hydrolyse der kovalenten Bindungen zwischen NEPC und Makromolekülen. Im Vergleich zur alkalischen Hydrolyse kann die Säurehydrolyse mehr phenolische Komponenten freisetzen, aber die hohe Temperatur, der hohe Säuregehalt und die längere Hydrolyse, die für die Säurehydrolyse erforderlich sind, können häufig zum Abbau der phenolischen Komponenten führen. Häufige phenolische Verbindungen in Pflanzen, wie z. B. Ferulasäure, binden sich oft über Esterbindungen an die Zellwände. Die meisten Studien verwenden alkalische Hydrolyse zur Analyse von NEPC in Pflanzen. Bei der Hydrolyse von NEPC mit anorganischen Basen wie Natriumhydroxid sind keine hohen Temperaturen erforderlich, aber die Reaktion muss oft unter Ausschluss von Licht und unter Stickstoffschutz durchgeführt werden, um den Abbau der phenolischen Komponenten zu verhindern.
Um die phenolischen Komponenten in Goji-Beeren umfassend zu bewerten, wurden in dieser Studie Säurehydrolyse und Alkalihydrolyse zur Entfernung freier phenolischer Komponenten aus Goji-Beeren eingesetzt. Die Ausbeute an phenolischen Bestandteilen wurde als Bewertungsindex verwendet, und die Auswirkungen der Säure-Base-Konzentration, der Hydrolysezeit und des Fest-Flüssig-Verhältnisses auf den Bewertungsindex wurden mit Hilfe von Einzelfaktorexperimenten und der Reaktionsflächenmethodik bewertet. Die Prozessbedingungen für die Alkalihydrolyse und die saure Hydrolyse wurden optimiert; und UPLC-Q-TOF-MS wurde zum Vergleich der phenolischen Komponenten in Proben verwendet, die mit verschiedenen Hydrolyseverfahren gewonnen wurden, und lieferte Hinweise für die Auswahl geeigneter Hydrolyseverfahren für verschiedene phenolische Komponenten.

 

Phenolverbindungen sind die am häufigsten vorkommenden Sekundärmetaboliten in Pflanzen und auch eine der am meisten betroffenen bioaktiven Substanzen. Phenolische Verbindungen kommen in Pflanzen sowohl in freier als auch in gebundener Form vor, wobei NEPC die Hauptkomponente der phenolischen Substanzen in Pflanzen sind. Die meisten bisherigen Studien konzentrierten sich auf die Zusammensetzung und die biologische Aktivität freier Phenole, während NEPC weniger Beachtung geschenkt wurde. Derzeit weisen immer mehr Studien darauf hin, dass NEPC ein wichtiger Wirkstoff in Lebensmitteln und in der natürlichen/traditionellen chinesischen Medizin sein könnten. In ähnlicher Weise wurden die freien Phenolbestandteile in Goji-Beeren sehr gründlich erforscht, aber es gab keine Berichte über NEPC. Die Voruntersuchungen des Forschungsteams ergaben, dass die Polysaccharide von Lycium barbarum mit schwachem Natriumhydroxid (0,2 mol/l) hydrolysiert werden können, um phenolische Substanzen zu erhalten, was auf das mögliche Vorhandensein von phenolischen Substanzen hinweist, die durch Esterbindungen verbunden sind. Es wird allgemein angenommen, dass NEPC mit Makromolekülen wie Cellulose, Proteinen und Lignin in Form von kovalenten Bindungen interagiert oder sich durch ionische Bindungen oder physikalische Wechselwirkungen an Pflanzenfasern oder in Zellen einbettet. Die NEPC in Goji-Beeren ist an Polysaccharide oder Pflanzensubstrate gebunden, was noch weiter bestätigt werden muss.
NEPC kann nicht direkt mit Wasser oder alkoholischen Lösungsmitteln extrahiert werden. Um NEPC in Gojibeeren zu analysieren, müssen alkalische oder saure Hydrolyseverfahren zur Herstellung von NEPC verwendet werden. Alkali kann die Esterbindungen zwischen phenolischen Komponenten und Substanzen wie Zucker, Proteinen, Pektin, Fasern usw. aufbrechen, wodurch Phenole freigesetzt und nachgewiesen werden können. Natriumhydroxid ist die am häufigsten verwendete alkalische Hydrolyseverbindung. Während der alkalischen Hydrolyse werden die phenolischen Bestandteile oft unter Bedingungen wie Sauerstoff, hohen Temperaturen und Licht abgebaut. Daher werden sie häufig bei niedrigen Temperaturen und in Abwesenheit von Licht unter Stickstoffschutz hydrolysiert. In dieser Studie wurde die Hydrolyse bei niedrigen Temperaturen ebenfalls unter Stickstoffschutz mit Natriumhydroxid als Hydrolysekatalysator durchgeführt. Bei der sauren Hydrolyse werden normalerweise starke Säuren wie Salzsäure verwendet. Salzsäure kann nicht nur Esterbindungen, sondern auch glykosidische Bindungen hydrolysieren und so effektiv Monomere oder Oligomere von NEPC freisetzen. In dieser Studie lag der durch alkalische Hydrolyse gemessene NEPC-Gehalt in Gojibeeren bei 0,65 ± 0,05 mg/100 g, während er bei den Produkten der sauren Hydrolyse 0,52 ± 0,03 mg/100 g betrug. Der Unterschied zwischen den beiden ist möglicherweise auf die unterschiedlichen Mechanismen der sauren und der alkalischen Hydrolyse zurückzuführen. Sowohl die Einzelfaktorexperimente als auch die Response-Surface-Experimente zeigten, dass die optimale Zeit für die alkalische Hydrolyse die gleiche war wie die für die saure Hydrolyse. Die Ausbeute der durch alkalische Hydrolyse hergestellten NEPC war jedoch höher, was darauf zurückzuführen sein könnte, dass die alkalische Hydrolyse die Bindung der NEPC an Strukturproteine, Ballaststoffe usw. stärker unterbricht. Die Säurebehandlung bricht die glykosidischen Bindungen und löst die Zucker auf. Unter sauren Bedingungen werden die Hydroxylgruppen in den Polyphenolmolekülen leicht protoniert, wodurch die Polyphenolmoleküle aufbrechen und Monomere oder Oligomere freisetzen. Unter alkalischen Bedingungen werden die Hydroxylgruppen in den Polyphenolmolekülen leichter deprotoniert als unter sauren Hydrolysebedingungen, was zu etwas höheren alkalischen Hydrolyseausbeuten und geringeren Verlusten führt.
Frühere Studien haben Unterschiede in den durch alkalische Hydrolyse und saure Hydrolyse gewonnenen NEPC festgestellt. Kaffeesäure, Catechine und Gallussäurederivate können in den Produkten der sauren Hydrolyse von Mehl nachgewiesen werden, während Ferulasäure nur in den Produkten der alkalischen Hydrolyse vorkommt, was darauf hindeutet, dass es möglicherweise mehr Arten von phenolischen Substanzen gibt, die durch saure Hydrolyse gewonnen werden. In dieser Studie wurde die Zusammensetzung der Substanzen in den NEPC-Hydrolyseprodukten von Gojibeeren mittels UPLC-Q-TOF-MS analysiert. Das Gesamtionenchromatogramm (siehe Abbildung 6) zeigte, dass es keinen Unterschied in der Art der Verbindungen zwischen alkalischen und sauren Hydrolyseprodukten gab, aber die Anzahl der sauren Hydrolyseprodukte war deutlich höher als die der alkalischen Hydrolyseprodukte. Dieses Phänomen kann auf die leichte Deprotonierung und Zerstörung der phenolischen Hydroxylgruppen in stark alkalischen Umgebungen zurückzuführen sein, wodurch sie durch Massenspektrometrie nicht nachweisbar sind, während phenolische Substanzen in sauren Umgebungen stabiler und leichter nachweisbar sind. Was die Produkte betrifft, so handelt es sich hauptsächlich um Phenylpropanoidderivate. Unter den 11 identifizierten Verbindungen befinden sich 8 Phenylpropanoide, 1 Cumarin, 1 Phenylpropanoid-Derivat und 1 Benzophenon. Im alkalischen Hydrolyseprodukt können nur vier Verbindungen identifiziert werden, wobei die Ferulasäure die wichtigste Substanz ist; alle 11 identifizierten Verbindungen können auch in sauren Hydrolyseprodukten nachgewiesen werden. Es ist erwähnenswert, dass unter den 8 Phenolsäuren 2 Verbindungen möglicherweise die Produkte der Cumarinlacton-Ringöffnung während der Hydrolyse von NEPC sind und nicht die nativen Substanzen in Goji-Beeren. Dies könnte mit der hohen Konzentration der im Hydrolyseprozess verwendeten Säuren zusammenhängen. In einem späteren Stadium kann die Konzentration von Säuren oder Basen verringert werden, um eine vollständigere Molekularstruktur zu erhalten. Außerdem besteht der in Goji-Beeren enthaltene NEPC hauptsächlich aus Phenylpropanoidsäure und Cumarin-Komponenten. Ob es noch andere Komponenten gibt, muss noch durch weitere Analysen der Hydrolyseprodukte geklärt werden. Um eine eingehende Analyse der NEPC in Goji-Beeren durchzuführen, sollte die Massenspektrometrie als Leitfaden in der späteren Phase verwendet werden, und die Konzentration von Säure/Alkali während der Hydrolyse sollte angepasst werden, um die echten nativen NEPC der Goji-Beeren zu erhalten.