A Lycium barbarum polifenolokkal kombinált lúgos hidrolízis és savas hidrolízis extrakciós eljárásainak összehasonlítása és termékelemzése
A fenolos anyagok széles körben elterjedtek a növényvilágban, beleértve a flavonoidokat, flavonoidokat, antociánokat, katechineket stb., és a növényekben az egyik legnagyobb mennyiségben előforduló másodlagos anyagcseretermék. Erőteljes antioxidáns tulajdonságaik és a különböző oxidatív stresszel kapcsolatos betegségek megelőzésében kifejtett jelentős hatásuk, például antioxidáns, gyulladáscsökkentő, daganatellenes, vérnyomáscsökkentő, hipoglikémiás és lipidcsökkentő hatásuk miatt a fenolos anyagok az élelmiszerekben és a természetes/hagyományos kínai orvoslásban egyre nagyobb figyelmet kapnak. A növényekben a fenolok szabad és kötött formában is léteznek, nevezetesen oldható fenolos anyagok, amelyek oldószerekkel kivonhatók, és nem kivonható fenolos vegyületek (NEPC), amelyek oldószerekkel közvetlenül nem vonhatók ki. Az utóbbiak kovalens kötéseken, például észterkötéseken és glikozidos kötéseken keresztül kötődnek makromolekulákhoz, például cukrokhoz, hemicellulózhoz, pektinhez és fehérjékhez, és a növényekben a fenolos komponensek fő formája. Az élelmiszerekben található fenolos anyagokkal kapcsolatos kutatások megállapították, hogy a NEPC jobb biológiai aktivitást mutat, mint a szabad fenolos anyagok. Például a szabad fenolokhoz képest a gabonában lévő NEPC nagyobb peroxid gyökfogó képességet és sejtantioxidáns aktivitást mutat. Általánosan elfogadott nézet, hogy a növényekben található fenolos anyagok biológiai aktivitása szorosan összefügg biológiai hozzáférhetőségükkel. A gyógyszeranyagcserével kapcsolatos kutatások megállapították, hogy a szabad fenolokat az emésztőnedvek lebonthatják, míg a NEPC a nagy molekulákkal való társulása miatt nem emésztődik. A bélbe kerülve a bél mikrobióta hidrolizálja, így biológiai aktivitást fejt ki, sőt, a tartós hatóanyag-leadású készítményekhez hasonló hatást fejt ki. Ezenkívül néhány NEPC más, az emberi szervezetre ható vegyületekké is átalakulhat. Ezért az élelmiszerekben és a természetes/hagyományos kínai gyógyászatban található NEPC mélyreható elemzése segíthet a fenolos anyagok biológiai aktivitásának átfogó értékelésében.
A Lycium barbarum L. a Solanaceae családba tartozó Lycium barbarum L. növény szárított és érett termése. A modern farmakológiai vizsgálatok kimutatták, hogy a Lycium barbarum számos potenciális biológiai aktivitással rendelkezik, amelyek többsége az antioxidáns aktivitáshoz kapcsolódik, amely a Lycium barbarum poliszacharidok és fenolos vegyületek szinergikus hatása. Kutatócsoportunk korábbi vizsgálatok során megállapította, hogy a Lycium barbarum poliszacharidok lúgos hidrolízisének termékeiben gallikusav és ferulasav mutatható ki, ami a NEPC jelenlétére utal. A vonatkozó vizsgálati eredmények arra utalnak, hogy a Lycium barbarumban lévő NEPC fontos szerepet játszik az antioxidáns aktivitásában. Jelenleg a goji bogyók fenolos vegyületeinek kutatása többnyire az oldható fenolokra összpontosít. A NEPC elhanyagolása alábecsülheti a goji bogyók teljes tartalmát, antioxidáns kapacitását és a fenolos vegyületek emberi egészségre gyakorolt pozitív hatását.
A NEPC elemzéséhez először megfelelő hidrolízis módszereket kell alkalmazni az észter- és glikozidos kötések felbontásához és a fenolos komponensek felszabadításához. Jelenleg az irodalomban leggyakrabban használt hidrolízis módszerek a savas hidrolízis és a lúgos hidrolízis. A tanulmányok mintegy 30%-je savval (általában sósavval vagy kénsavval) hidrolizálja a NEPC és a makromolekulák közötti kovalens kötéseket. A lúgos hidrolízishez képest a savas hidrolízis több fenolos komponenst képes felszabadítani, de a savas hidrolízishez szükséges magas hőmérséklet, magas savassági körülmények és az elhúzódó hidrolízis gyakran a fenolos komponensek lebomlásához vezethet. A növényekben gyakori fenolos vegyületek, mint például a ferulasav, gyakran észterkötéseken keresztül kötődnek a sejtfalakhoz. A legtöbb tanulmány lúgos hidrolízist használ a növényekben lévő NEPC elemzésére. A NEPC szervetlen bázisokkal, például nátrium-hidroxiddal történő hidrolízisénél nincs szükség magas hőmérsékletre, de a reakciót gyakran fénymentesen, nitrogénvédelem mellett kell elvégezni a fenolos komponensek lebomlásának megakadályozása érdekében.
A goji bogyók fenolos összetevőinek átfogó értékelése érdekében ez a tanulmány savas hidrolízist és lúgos hidrolízist alkalmazott a szabad fenolos összetevők eltávolítására a goji bogyókból. A fenolos komponensek hozamát használtuk értékelési indexként, és egytényezős kísérleteket és válaszfelület-módszertant alkalmaztunk a sav-bázis koncentráció, a hidrolízis ideje és a szilárd-folyadék arány értékelési indexre gyakorolt hatásának értékelésére. A lúgos hidrolízis és a savas hidrolízis folyamatfeltételeit optimalizáltuk; az UPLC-Q-TOF-MS-t pedig a különböző hidrolízis módszerekkel nyert minták fenolos komponenseinek összehasonlítására használtuk, referenciát szolgáltatva a különböző fenolos komponensek megfelelő hidrolízis módszereinek kiválasztásához.

 

A fenolos vegyületek a növényekben a legnagyobb mennyiségben előforduló másodlagos anyagcseretermékek, és egyben az egyik leginkább érintett bioaktív anyag. A növényekben a fenolos vegyületek szabad és kötött formában is léteznek, a NEPC a növények fenolos anyagainak fő összetevője. A legtöbb korábbi tanulmány a szabad fenolok összetételére és biológiai aktivitására összpontosított, és kevesebb figyelmet fordított a NEPC-re. Jelenleg egyre több tanulmány utal arra, hogy a NEPC fontos hatóanyag lehet az élelmiszerekben és a természetes/hagyományos kínai gyógyászatban. Hasonlóképpen, a goji bogyók szabad fenolos komponenseinek kutatása nagyon alapos volt, de a NEPC-ről nem számoltak be. A kutatócsoport előzetes kutatásai szerint a Lycium barbarum poliszacharidok gyenge nátrium-hidroxiddal (0,2mol/L) hidrolizálhatók, így fenolos anyagok nyerhetők, ami jelzi az észterkötésekkel összekapcsolt fenolos anyagok lehetséges jelenlétét. Általában úgy vélik, hogy a NEPC kovalens kötés formájában lép kölcsönhatásba a makromolekulákkal, például a cellulózzal, a fehérjékkel és a ligninnel, vagy ionos kötések vagy fizikai kölcsönhatások révén kötődik a növényi rostokhoz vagy a sejtekbe ágyazódva. A goji bogyókban lévő NEPC poliszacharidokhoz vagy növényi szubsztrátokhoz kapcsolódik, és további megerősítésre van szükség.
A NEPC nem vonható ki közvetlenül vízzel vagy alkoholos oldószerekkel. A goji bogyókban lévő NEPC elemzéséhez lúgos hidrolízis vagy savas hidrolízis módszereket kell alkalmazni a NEPC előállításához. A lúg képes a fenolos komponensek és az olyan anyagok, mint a cukrok, fehérjék, pektin, rostok stb. közötti észterkötéseket megbontani, ezáltal fenolokat szabadít fel és detektálhatók. A nátrium-hidroxid a leggyakrabban használt lúgos hidrolízis vegyület. A lúgos hidrolízis során a fenolos komponensek gyakran lebomlanak olyan körülmények között, mint az oxigén, a magas hőmérséklet és a fény. Ezért gyakran alacsony hőmérsékleten, fény hiányában, nitrogénvédelem mellett hidrolizálják őket. Ebben a tanulmányban az alacsony hőmérsékletű hidrolízist szintén nitrogénvédelem alatt végezték, nátrium-hidroxidot használva hidrolíziskatalizátorként. A savas hidrolízishez általában erős savakat, például sósavat használnak. A sósav nemcsak az észterkötéseket, hanem a glikozidos kötéseket is hidrolizálni tudja, hatékonyan felszabadítva a NEPC monomerjeit vagy oligomerjeit. Ebben a vizsgálatban a lúgos hidrolízissel mért NEPC a goji bogyókban 0,65 ± 0,05 mg/100 g volt, míg a savas hidrolízis termékeiben 0,52 ± 0,03 mg/100 g. A kettő közötti különbség a savas hidrolízis és a lúgos hidrolízis eltérő mechanizmusának tudható be. Mind az egytényezős kísérletek, mind a válaszfelületi kísérletek azt mutatták, hogy a lúgos hidrolízishez szükséges optimális idő megegyezett a savas hidrolízishez szükséges idővel. A lúgos hidrolízissel előállított NEPC hozama azonban magasabb volt, ami annak tudható be, hogy a lúgos hidrolízis jobban megszakította a NEPC kötődését a strukturális fehérjékhez, élelmi rostokhoz stb. A savas kezelés felbontja a glikozidos kötéseket és feloldja a cukrokat. Savas körülmények között a polifenol molekulák hidroxilcsoportjai könnyen protonálódnak, ami a polifenol molekulák felbomlását és monomerek vagy oligomerek felszabadulását okozza. A savas hidrolízis magas hőmérsékleten egyes fenolos anyagok elvesztését eredményezheti; Lúgos körülmények között a polifenolmolekulák hidroxilcsoportjai könnyebben deprotonálódnak, mint savas hidrolízis körülmények között, ami valamivel magasabb lúgos hidrolízishozamot és kisebb veszteségeket eredményez.
Korábbi tanulmányok különbséget találtak a lúgos hidrolízissel és savas hidrolízissel nyert NEPC-ben. A liszt savas hidrolízisének termékeiben kimutatható a kávésav, a katechinek és a galluszármazékok, míg a ferulasav csak a lúgos hidrolízis termékeiben létezik, ami arra utal, hogy a savas hidrolízisből többféle fenolos anyagot nyerhetünk. Ez a tanulmány UPLC-Q-TOF-MS-t használt a goji bogyók NEPC hidrolízis termékeiben lévő anyagok összetételének elemzésére. A teljes ionkromatogram (lásd a 6. ábrát) azt mutatta, hogy a vegyületek típusai között nem volt különbség a lúgos hidrolízis és a savas hidrolízis termékei között, de a savas hidrolízis termékeinek száma jelentősen magasabb volt, mint a lúgos hidrolízis termékeinek száma. Ennek a jelenségnek az lehet az oka, hogy erős lúgos környezetben a fenolos hidroxilcsoportok könnyen deprotonálódnak és megsemmisülnek, ami miatt tömegspektrometriával nem mutathatók ki, míg savas környezetben a fenolos anyagok stabilabbak és könnyebben kimutathatók; Másrészt a lúgos hidrolízis csak a fenolok és a makromolekulák közötti észterkötéseket képes felbontani, míg a savak nemcsak az észterkötéseket, hanem a glikozidos kötéseket is képesek hidrolizálni, így többféle fenolos anyagot lehet kimutatni. A termékek szempontjából a legfontosabbak a fenilpropanoid-származékok. A 11 azonosított vegyület között 8 fenilpropanoid, 1 kumarin, 1 fenilpropanoid-származék és 1 benzofenon található. A lúgos hidrolízis termékben csak négy vegyület azonosítható, a ferulasav a fő anyag; a savas hidrolízis termékben pedig mind a 11 azonosított vegyület kimutatható. Érdemes megjegyezni, hogy a 8 fenolsav közül 2 vegyület a NEPC hidrolízise során a kumarin-laktongyűrű felnyílásának terméke lehet, nem pedig a goji bogyóban lévő natív anyagok. Ez összefügghet a hidrolízis során használt savak magas koncentrációjával. A későbbi szakaszban a savak vagy bázisok koncentrációja csökkenthető a teljesebb molekulaszerkezet elérése érdekében. Ezenkívül a goji bogyókban található NEPC főleg fenilpropanoid sav és kumarin komponensekből áll. Hogy vannak-e más komponensek is, az még a hidrolízistermékek további elemzését igényli. A goji bogyókban lévő NEPC mélyreható elemzésének elvégzése érdekében a tömegspektrometriás detektálást a későbbi szakaszban útmutatóként kell használni, és a hidrolízis során a sav/alkáli koncentrációját úgy kell beállítani, hogy a goji bogyókhoz tartozó valódi natív NEPC-t kapjuk.