Сравнение и анализ продуктов процессов экстракции Lycium barbarum щелочным гидролизом и кислотным гидролизом в сочетании с полифенолами
Фенольные вещества широко распространены в растительном царстве, включая флавоноиды, флавоны, антоцианы, катехины и т.д., и являются одними из самых распространенных вторичных метаболитов в растениях. Благодаря своим мощным антиоксидантным свойствам и значительным эффектам в предотвращении различных заболеваний, связанных с окислительным стрессом, таким как антиоксидантное, противовоспалительное, противоопухолевое, гипотензивное, гипогликемическое и липидоснижающее действие, фенольные вещества в продуктах питания и натуральной/традиционной китайской медицине привлекают все больше внимания. В растениях фенолы существуют как в свободной, так и в связанной форме, а именно: растворимые фенольные вещества, которые могут быть извлечены растворителями, и неэкстрагируемые фенольные соединения (NEPC), которые не могут быть непосредственно извлечены растворителями. Последние связываются с макромолекулами, такими как сахара, гемицеллюлоза, пектин и белки, посредством ковалентных связей, таких как эфирные и гликозидные связи, и являются основной формой фенольных компонентов в растениях. Исследования фенольных веществ в продуктах питания показали, что NEPC проявляют лучшую биологическую активность, чем свободные фенольные вещества. Например, по сравнению со свободными фенолами, NEPC в зерне демонстрирует более высокую способность к сжиганию перекисных радикалов и клеточную антиоксидантную активность. Принято считать, что биологическая активность фенольных веществ в растениях тесно связана с их биодоступностью. Исследования метаболизма лекарств показали, что свободные фенолы могут быть разложены пищеварительными соками, в то время как NEPC не переваривается из-за своей связи с крупными молекулами. После попадания в кишечник он подвергается гидролизу микробиотой кишечника, проявляя биологическую активность и даже демонстрируя эффекты, схожие с препаратами с длительным высвобождением. Кроме того, некоторые NEPC могут преобразовываться в другие соединения, влияющие на организм человека. Поэтому углубленный анализ NEPC в продуктах питания и натуральной/традиционной китайской медицине может помочь всесторонне оценить биологическую активность фенольных веществ.
Lycium barbarum L. - это высушенные и зрелые плоды Lycium barbarum L., растения семейства пасленовых (Solanaceae). Современные фармакологические исследования показали, что Lycium barbarum обладает множеством потенциальных биологических активностей, большинство из которых связаны с антиоксидантной активностью, которая представляет собой синергетический эффект полисахаридов Lycium barbarum и фенольных соединений. Наша исследовательская группа в ходе предыдущих исследований обнаружила, что галловая и феруловая кислоты могут быть обнаружены в продуктах щелочного гидролиза полисахаридов Lycium barbarum, что указывает на присутствие NEPC. Соответствующие результаты анализа позволяют предположить, что NEPC в Lycium barbarum играют важную роль в его антиоксидантной активности. В настоящее время исследования фенольных соединений в ягодах годжи в основном сосредоточены на растворимых фенолах. Пренебрежение NEPC может привести к недооценке общего содержания, антиоксидантной способности и положительного влияния фенольных соединений в ягодах годжи на здоровье человека.
Для анализа NEPC необходимо сначала использовать соответствующие методы гидролиза, чтобы разрушить эфирные и гликозидные связи и высвободить фенольные компоненты. В настоящее время в литературе наиболее часто используются такие методы гидролиза, как кислотный гидролиз и щелочной гидролиз. Примерно в 30% исследованиях для гидролиза ковалентных связей между NEPC и макромолекулами используется кислота (обычно соляная или серная). По сравнению со щелочным гидролизом, кислотный гидролиз может высвободить больше фенольных компонентов, но высокая температура, условия повышенной кислотности и длительный гидролиз, необходимые для кислотного гидролиза, часто приводят к деградации фенольных компонентов. Распространенные фенольные соединения в растениях, такие как феруловая кислота, часто связываются с клеточными стенками через эфирные связи. В большинстве исследований для анализа NEPC в растениях используется щелочной гидролиз. При гидролизе NEPC с использованием неорганических оснований, таких как гидроксид натрия, не требуется высокая температура, но реакция часто должна проводиться в отсутствие света под защитой азота, чтобы предотвратить деградацию фенольных компонентов.
Чтобы всесторонне оценить содержание фенольных компонентов в ягодах годжи, в данном исследовании для удаления свободных фенольных компонентов из ягод годжи использовали кислотный гидролиз и щелочной гидролиз. В качестве показателя оценки использовался выход фенольных компонентов, а для оценки влияния концентрации кислоты и щелочи, времени гидролиза и соотношения твердой и жидкой фаз на показатель оценки применялись однофакторные эксперименты и методология поверхности отклика. Условия процесса щелочного гидролиза и кислотного гидролиза были оптимизированы, а UPLC-Q-TOF-MS использовался для сравнения фенольных компонентов в образцах, полученных различными методами гидролиза, обеспечивая ссылку для выбора соответствующих методов гидролиза для различных фенольных компонентов.

 

Фенольные соединения являются наиболее распространенными вторичными метаболитами в растениях, а также одними из самых важных биологически активных веществ. Фенольные соединения в растениях существуют как в свободной, так и в связанной форме, при этом основным компонентом фенольных веществ в растениях является NEPC. Большинство предыдущих исследований было посвящено изучению состава и биологической активности свободных фенолов, при этом NEPC уделялось меньше внимания. В настоящее время все большее число исследований указывает на то, что NEPC может быть важным активным веществом в продуктах питания и натуральной/традиционной китайской медицине. Аналогичным образом, исследования свободных фенольных компонентов в ягодах годжи были очень глубокими, но не было никаких сообщений о NEPC. Предварительные исследования группы ученых показали, что полисахариды Lycium barbarum могут быть гидролизованы слабым гидроксидом натрия (0,2 моль/л) для получения фенольных веществ, что указывает на возможное присутствие фенольных веществ, связанных сложноэфирными связями. Обычно считается, что NEPC взаимодействует с макромолекулами, такими как целлюлоза, белки и лигнин, в форме ковалентных связей, либо связывается с растительными волокнами или встраивается в клетки посредством ионных связей или физических взаимодействий. Связь NEPC в ягодах годжи с полисахаридами или растительными субстратами требует дальнейшего подтверждения.
NEPC нельзя извлечь напрямую с помощью воды или спиртовых растворителей. Для анализа NEPC в ягодах годжи необходимо использовать методы щелочного или кислотного гидролиза для приготовления NEPC. Щелочь может разрушить эфирные связи между фенольными компонентами и такими веществами, как сахара, белки, пектин, волокна и т. д., в результате чего высвобождаются фенолы и становятся доступными для обнаружения. Гидроксид натрия - наиболее часто используемое соединение для щелочного гидролиза. В процессе щелочного гидролиза фенольные компоненты часто подвергаются разрушению в таких условиях, как кислород, высокая температура и свет. Поэтому их часто гидролизуют при низких температурах в отсутствие света под защитой азота. В данном исследовании низкотемпературный гидролиз также проводился под защитой азота с использованием гидроксида натрия в качестве катализатора гидролиза. При кислотном гидролизе обычно используются сильные кислоты, такие как соляная кислота. Соляная кислота может не только гидролизовать сложноэфирные связи, но и гидролизовать гликозидные связи, эффективно высвобождая мономеры или олигомеры NEPC. В этом исследовании содержание NEPC в ягодах годжи, измеренное щелочным гидролизом, составило 0,65 ± 0,05 мг/100 г, в то время как в продуктах кислотного гидролиза оно составило 0,52 ± 0,03 мг/100 г. Разница между этими двумя показателями может быть обусловлена различными механизмами кислотного и щелочного гидролиза. Как однофакторные эксперименты, так и эксперименты с поверхностью отклика показали, что оптимальное время, необходимое для щелочного гидролиза, было таким же, как и для кислотного гидролиза. Однако выход НЭПК, приготовленных щелочным гидролизом, был выше, что может быть связано с тем, что щелочной гидролиз в большей степени нарушает связывание НЭПК со структурными белками, пищевыми волокнами и т.д. Кислотная обработка разрушает гликозидные связи и растворяет сахара. В кислотных условиях гидроксильные группы в молекулах полифенолов легко протонируются, в результате чего молекулы полифенолов разрываются и высвобождают мономеры или олигомеры. Кислотный гидролиз при высоких температурах может привести к потере некоторых фенольных веществ. В щелочных условиях гидроксильные группы в молекулах полифенолов депротонируются легче, чем при кислотном гидролизе, что приводит к несколько более высоким выходам при щелочном гидролизе и снижению потерь.
Предыдущие исследования выявили различия в NEPC, полученных путем щелочного гидролиза и кислотного гидролиза. Кофейная кислота, катехины и производные галловой кислоты могут быть обнаружены в продуктах кислотного гидролиза муки, в то время как феруловая кислота присутствует только в продуктах щелочного гидролиза, что указывает на то, что при кислотном гидролизе может быть получено больше типов фенольных веществ. В данном исследовании использовалась UPLC-Q-TOF-MS для анализа состава веществ в продуктах гидролиза NEPC ягод годжи. Хроматограмма суммарных ионов (см. рис. 6) показала отсутствие разницы в типах соединений между продуктами щелочного и кислотного гидролиза, однако количество продуктов кислотного гидролиза было значительно выше, чем продуктов щелочного гидролиза. Это явление может быть связано с легким депротонированием и разрушением фенольных гидроксильных групп в сильной щелочной среде, что делает их необнаружимыми с помощью масс-спектрометрии, в то время как фенольные вещества более стабильны и легче обнаруживаются в кислой среде. С другой стороны, щелочной гидролиз может разрушить только эфирные связи между фенолами и макромолекулами, тогда как кислоты могут гидролизовать не только эфирные, но и гликозидные связи, поэтому существует больше типов фенольных веществ, которые могут быть обнаружены. С точки зрения продуктов, основными являются производные фенилпропаноидов. Среди 11 идентифицированных соединений 8 фенилпропаноидов, 1 кумарин, 1 производное фенилпропаноида и 1 бензофенон. В продукте щелочного гидролиза можно идентифицировать только четыре соединения, причем основным веществом является феруловая кислота; в продуктах кислотного гидролиза можно обнаружить все 11 идентифицированных соединений. Стоит отметить, что среди 8 фенольных кислот 2 соединения могут быть продуктами раскрытия кумаринового лактонного кольца при гидролизе NEPC, а не родными веществами ягод годжи. Это может быть связано с высокой концентрацией кислот, используемых в процессе гидролиза. На более поздней стадии концентрация кислот или оснований может быть снижена для получения более полной молекулярной структуры. Кроме того, NEPC, содержащиеся в ягодах годжи, состоят в основном из фенилпропаноидных кислот и кумариновых компонентов. Наличие других компонентов требует дальнейшего анализа продуктов гидролиза. Для проведения углубленного анализа NEPC в ягодах годжи, масс-спектрометрическое определение должно быть использовано в качестве руководства на более поздней стадии, а концентрация кислоты/щелочи во время гидролиза должна быть скорректирована для получения истинного нативного NEPC, принадлежащего ягодам годжи.