Идентификация характерных пептидов из различных примитивных пиявок
В Фармакопее Китайской Народной Республики издания 2020 года (далее - "Фармакопея") указано, что пиявка традиционной китайской медицины - это высушенное целое животное семейства пиявочных, пиявка Whitman pigra Whitman, пиявка Hirudo nipponica Whitman или пиявка Whitman acranulata Whitman. Вкус у нее соленый, горький и мягкий; есть небольшой токсин, который относится к меридиану печени. Его функция - разгонять кровь и способствовать ее циркуляции, устранять застой крови и ликвидировать застойные явления. Он широко используется при застое крови и непроходимости меридианов, при лечении массовых заболеваний, гемиплегии инсульта, падений и травм. В последние годы значительно увеличилось число пациентов с сердечно-сосудистыми и цереброваскулярными заболеваниями, что привело к росту спроса на лекарственное сырье из пиявок. Однако на рынке представлено множество сложных и разных по качеству лекарственных средств из пиявок. Помимо пиявок, на рынке присутствует фальсифицированный продукт под названием Poecilobdra manillensis Lesson. В настоящее время и пиявки, и пиявники - это высушенные продукты, имеющие значительные различия во внешнем виде и характеристиках, что позволяет легко их различать. Поэтому данное исследование посвящено только изучению различного происхождения пиявок. Обзор литературы показал, что современные исследования пиявок сосредоточены на механизмах антикоагулянтов и определении аминокислот, в то время как комплексных исследований качества различных примитивных пиявок и их смесей относительно мало. Идентификационные исследования между различными примитивными пиявками в основном основаны на идентификации признаков в соответствии с изданием 2020 года Китайской фармакопеи. В некоторых исследованиях с помощью методов молекулярной идентификации ДНК и анализа белков было установлено, что технология молекулярной идентификации ДНК пиявки может быть установлена с помощью ПЦР, а белки различных примитивных пиявок могут быть различимы с помощью SDS-PAGE и 2-DE. Кроме того, существуют исследования, которые также могут различать их на основе методов спектральной характеристики ВЭЖХ или высокопроизводительного секвенирования, но такие методы имеют проблемы, такие как длительное время обнаружения и низкая популярность инструментов обнаружения. В данном исследовании для обнаружения пептида пиявки I и пептида пиявки II использовался метод ЖХ-МС. Созданный метод обладает высокой специфичностью, высокой чувствительностью, коротким временем анализа и может быть использован для различения пиявок различного происхождения, повышения уровня контроля их качества, а также для обоснования безопасности и эффективности клинического применения соответствующих препаратов.

Идентификация лекарственных материалов животного происхождения всегда была ключевым и сложным вопросом в исследованиях традиционной китайской медицины. Однако существующие методы идентификации в основном опираются на традиционные методы идентификации, которые обладают сильным субъективизмом и требуют от дискриминатора серьезных профессиональных знаний и опыта. Не хватает научных, эффективных и точных методов идентификации, основанных на современных методах обнаружения. Пиявка - ценный традиционный китайский препарат, имеющий большое лечебное и исследовательское значение. Лекарственная ценность пиявок также признана во всем мире, и пиявки использовались для лечения заболеваний в Европе, Египте и Индии. В издании Китайской фармакопеи 2020 года указано, что пиявки содержат три основных элемента, но в настоящее время Китайская фармакопея контролирует их только с помощью таких тестов, как влажность, общее содержание золы, кислотность и щелочность, а также антитромбиновая активность. В настоящее время нет данных о дифференцированной характеристике различных основных элементов, что не имеет научного обоснования и не позволяет идентифицировать отвар или рецептуру лекарственного сырья после кипячения.
В данном исследовании было протестировано 22 партии пиявок различного происхождения, включая 15 партий пиявок, 2 партии пиявок из листьев ивы и 5 партий пиявок. Результаты показали, что все 15 партий пиявок могли обнаружить хроматографические пики пептида пиявки I и пептида пиявки II, 2 партии пиявок из листьев ивы могли обнаружить только пептид пиявки II, а 5 партий пиявок - только пептид пиявки I. Из результатов проверки видно, что пиявки различного происхождения могут быть отличимы путем измерения пептида пиявки I и пептида пиявки II. С помощью анализа PLS-DA можно увидеть, что пиявки различного происхождения могут быть четко разделены на три категории, и результаты анализа согласуются с результатами идентификации происхождения. Согласно другим документам, активность полипептида гирудо в основном заключается в антикоагулянтной активности, а также включает ингибирование протеаз, противовоспалительную, гидролазную, ингибирование миграции макрофагов при атеросклерозе и другие фармакологические активности. Это говорит о том, что помимо аминокислот и нуклеозидов, полипептид гирудо также является одним из основных компонентов его фармакологического действия. Однако все вышеперечисленные документы посвящены фармакологическому изучению полипептида, а метод обнаружения полипептида не был разработан. В данной работе используется метод LC-MS для определения полипептида гирудо с учетом методов экстракции и проверки других разновидностей полипептида, обеспечивая научно-техническое средство для контроля качества, которое может отражать качество фармакологического эффекта путем измерения площади пика полипептида гирудо; Кроме того, в пункте определения содержания пиявок в Китайской фармакопее указано, что "антитромбиновая активность пиявок не должна быть меньше 16.0U на 1 г; пиявки и пиявки из листьев ивы должны быть не менее 3,0U". Это говорит о том, что пиявки имеют значительные различия в антитромбиновой активности по сравнению с пиявками и ивовыми листьями, то есть пиявки разного происхождения имеют значительные различия в качестве. Поэтому использование данного метода для быстрого и точного различения лекарственного сырья пиявок различного происхождения, их водных отваров, препаратов и т.д., утративших свои основные свойства, имеет большое значение для повышения качества пиявок и сопутствующих продуктов.
Метод, разработанный в этом исследовательском институте, обладает такими характеристиками, как быстрота, эффективность и воспроизводимость, что позволяет повысить уровень контроля качества, а также обеспечить эталон безопасности и эффективности клинического применения препаратов, связанных с пиявками. Он эффективно решает проблему пиявок, которые долгое время могут различаться по происхождению только с помощью традиционных методов идентификации.