Purification et activité neuroprotectrice de MIP-16, un peptide dérivé de Morchella edulis
La maladie de Parkinson (MP) est la deuxième maladie neurodégénérative la plus importante chez l'homme, avec un taux de prévalence de 2% à 3% chez les personnes âgées de 65 ans et plus. Les caractéristiques pathologiques de la MP peuvent se résumer à la perte d'un grand nombre de neurones dopaminergiques dans la substantia nigra pars compacta, entraînant une diminution de la biosynthèse de la dopamine dans la substantia nigra et le striatum. Le mécanisme pathogène de la MP n'est pas encore clair. Des études ont confirmé que des facteurs environnementaux, des facteurs génétiques, le stress oxydatif et d'autres facteurs peuvent être impliqués dans la dégénérescence et la mort des neurones dopaminergiques dans la MP. Parmi ces facteurs, le stress oxydatif est une cause importante de dégénérescence neuronale. D'une part, le cerveau est l'organe qui consomme le plus d'oxygène dans les activités physiologiques normales de l'homme, mais le manque relatif d'enzymes antioxydantes dans le cerveau le rend très sensible aux dommages causés par le stress oxydatif ; D'autre part, des études préliminaires ont montré qu'une augmentation du stress oxydatif mitochondrial dans les neurones dopaminergiques de la substantia nigra pars compacta peut déclencher une cascade toxique dépendante de la dopamine, conduisant à un dysfonctionnement lysosomal et à une accumulation d'alpha synucléine, qui sont les deux principales caractéristiques pathologiques de la maladie de Parkinson. À l'heure actuelle, la thérapie classique de remplacement de la dopamine, telle que la supplémentation en L-3,4-dihydroxyphénylalanine (L-DOPA), est principalement utilisée en médecine pour traiter la maladie de Parkinson. Mais de plus en plus d'études ont montré que cette thérapie classique avait des effets secondaires importants. Des observations cliniques ont montré qu'un traitement à long terme à la L-DOPA avait une certaine probabilité de provoquer des troubles du mouvement chez les patients atteints de la maladie de Parkinson. Par conséquent, la réduction du stress oxydatif et la recherche de nouveaux agents neuroprotecteurs constituent l'un des moyens potentiels de prévenir et de traiter la maladie de Parkinson.
Ces dernières années, l'extraction et la purification d'agents neuroprotecteurs ayant une activité antioxydante à partir de produits naturels ont fait l'objet d'une grande attention et des progrès significatifs ont été réalisés. Le salidroside extrait des racines de Rhodiola rosea L., une plante de la famille des Sedaceae, peut inhiber le stress oxydatif et l'inflammation pour protéger les cellules PC12 apoptotiques. La paeoniflorine atténue l'apoptose induite par la 6-hydroxydopamine dans les cellules PC12 en inhibant l'activation de NF - κ B. Cependant, par rapport aux plantes, les recherches sur les agents neuroprotecteurs fongiques sont relativement moins nombreuses. Certains polysaccharides fongiques peuvent présenter une bonne activité de piégeage des radicaux libres et exercer des effets neuroprotecteurs. Cependant, les polysaccharides fongiques ont un poids moléculaire élevé, une structure complexe et pénètrent difficilement la barrière hémato-encéphalique, ce qui limite leur application en tant qu'agents neuroprotecteurs. Les extraits d'éthanol ou d'eau de certains champignons contiennent des facteurs neuroprotecteurs, mais la composition des extraits n'est pas encore claire et la structure des substances fonctionnelles doit être identifiée.
Morchella spp. est un champignon comestible et médicinal précieux, qui figure dans le Compendium of Materia Medica comme étant "doux et froid, non toxique, résolvant les mucosités et régulant le qi, et bénéfique pour le tractus gastro-intestinal". Morchella importuna M. Kuo. est une variété largement cultivée en Chine. Nos recherches antérieures ont confirmé que l'extrait aqueux de Morchella importuna contient une substance ressemblant au facteur de croissance des nerfs (NGF), qui peut promouvoir la différenciation des cellules PC12 et former des réseaux neuronaux. Sur cette base, cette étude a permis de purifier et d'identifier les composants fonctionnels du corps fructifère de Morchella prolifera, de construire un modèle de cellules PC12 endommagées par le 6-OHDA, de vérifier l'activité neuroprotectrice des composants fonctionnels du corps fructifère de Morchella prolifera, de fournir des données pour le développement des bienfaits pour la santé de Morchella prolifera cultivée artificiellement et de fournir des ressources alternatives pour le criblage d'agents neuroprotecteurs dérivés de champignons.

Certains grands champignons ont une valeur alimentaire et médicinale extrêmement élevée et sont riches en protéines, ce qui en fait des matières premières idéales pour obtenir des peptides naturels. La cordymine est un peptide extrait du Cordyceps sinensis, qui peut inhiber l'inflammation et atténuer les lésions cérébrales causées par l'ischémie et l'hypoxie chez les rats. Le peptide PEMP isolé du mycélium de Pleurotus eryngii a des fonctions antioxydantes, antitumorales et de renforcement immunitaire. À l'heure actuelle, les ingrédients actifs des champignons se concentrent principalement sur la recherche de polysaccharides. Comparés aux polysaccharides fongiques, les peptides ont une structure simple, une faible immunogénicité et sont faciles à synthétiser artificiellement, ce qui en fait un élément très prometteur du développement de médicaments modernes. Actuellement, les méthodes de colonne chromatographique sont souvent utilisées pour séparer et purifier les polypeptides des hydrolysats de protéines, y compris la chromatographie d'échange d'ions et/ou la chromatographie de filtration sur gel. Les premières peuvent être séparées en fonction de la charge des ions et des molécules polaires, tandis que les secondes peuvent être séparées en fonction de la taille moléculaire. Cependant, il n'existe actuellement aucun rapport sur les méthodes standard d'extraction des peptides fongiques, et la valeur du pH du tampon d'extraction ainsi que la nécessité ou non d'une hydrolyse protéasique au cours du processus d'extraction n'ont pas été étudiées. En outre, l'extraction de peptides à partir de différents types de champignons correspond souvent à des méthodes d'extraction différentes, ce qui ne favorise pas la promotion et l'application des peptides fongiques. Comparée à la méthode d'extraction standard pour la maturité des polysaccharides fongiques, la méthode d'extraction des peptides fongiques doit faire l'objet d'une exploration plus poussée. Dans cette étude, le MIP-16 a été purifié en utilisant une combinaison de chromatographie d'exclusion moléculaire et de chromatographie liquide inverse à haute performance. La méthode a d'abord divisé grossièrement les molécules en fonction de leur taille, puis les a subdivisées en fonction de leur polarité. L'expérience a prouvé que cette méthode a une bonne capacité de discrimination, mais le temps d'expérimentation requis est relativement long et des améliorations supplémentaires sont nécessaires.
La dégénérescence et la mort cellulaire des neurones dopaminergiques dans le striatum substantia nigra entraînent une carence en dopamine, qui est la principale cause de la maladie de Parkinson. Par conséquent, la thérapie de remplacement de la dopamine (telle que la supplémentation en L-DOPA) est actuellement l'une des meilleures méthodes pour traiter la maladie de Parkinson idiopathique, qui soulage les symptômes grâce à la supplémentation en dopamine exogène. Toutefois, après la période initiale de réponse optimale au traitement, le traitement à long terme à la L-DOPA s'accompagne souvent d'effets secondaires tels que la perte de la fonction motrice. En outre, des chercheurs ont détecté la présence de 6-OHDA dans l'urine de patients atteints de la maladie de Parkinson qui prenaient de la L-DOPA depuis longtemps. Par conséquent, dans cette étude, nous avons traité des cellules PC12 avec du 6-OHDA pour simuler l'apparition précoce de la maladie de Parkinson et rechercher de nouveaux agents neuroprotecteurs. Dans notre étude, nous avons constaté que le traitement à la 6-OHDA augmente le niveau de ROS dans les cellules PC12, ce qui déclenche à son tour l'apoptose cellulaire. Nous supposons que le traitement à long terme à la L-DOPA peut produire plus de 6-OHDA, ce qui peut avoir un effet de rétroaction négatif sur le traitement de la MP. Sur la base de l'analyse ci-dessus, en partant de la réduction de la pression oxydative et de la minimisation des dommages oxydatifs, il est prévu de rechercher des agents neuroprotecteurs efficaces et sûrs. Les polysaccharides, peptides, triterpènes et autres composants contenus dans les champignons supérieurs ont une bonne activité antioxydante. C'est pourquoi nous recherchons des agents neuroprotecteurs dans les champignons afin de fournir des ressources pour le criblage de médicaments dans la MP.
Les réactions d'oxydation peuvent fournir de l'énergie pour les activités de la vie humaine, mais les radicaux anions superoxydes et les radicaux hydroxyles générés au cours de la réaction peuvent causer des dommages oxydatifs. La présence d'enzymes antioxydantes endogènes et d'autres antioxydants tend à équilibrer la production et la consommation de ROS, maintenant un état stable dans des conditions normales. Cependant, des études ont montré qu'avec l'âge, l'efficacité du système antioxydant diminue progressivement. Dans la population âgée, l'augmentation des espèces réactives de l'oxygène dépasse la capacité d'élimination du système antioxydant, entraînant un stress oxydatif et pouvant causer des maladies neurodégénératives telles que la maladie de Parkinson. Les enzymes antioxydantes endogènes, notamment la superoxyde dismutase (SOD), la catalase (CAT), la glutathion peroxydase (GSH Px), etc., constituent le système de défense naturel de l'organisme contre le stress oxydatif. Après un traitement au 6-OHDA, l'activité intracellulaire des enzymes antioxydantes a diminué de manière significative. On peut en déduire qu'à ce moment-là, le système enzymatique antioxydant intracellulaire dépasse largement la charge normale. Le prétraitement au MIP-16 pendant 6 heures a augmenté de manière significative l'activité enzymatique antioxydante endogène dans les cellules PC12. Les niveaux de SOD reflètent la charge du système enzymatique antioxydant intracellulaire et indirectement le niveau de radicaux libres intracellulaires. Ce résultat peut indiquer que la génération de superoxyde anionique a été réduite après le prétraitement au MIP-16. En outre, la GSH Px est un élément central de la défense antioxydante cellulaire et un donneur d'électrons pour les ROS, ce qui suggère que le MIP-16, en tant qu'autre système de détoxification, peut affecter le métabolisme du GSH et éviter la mort cellulaire induite par le 6-OHDA.
Lorsque le système enzymatique antioxydant endogène ne peut pas éliminer les ROS en temps voulu, ces derniers peuvent facilement endommager les biomolécules, ce qui conduit finalement à l'apoptose de la cellule. Bcl-2 et Bax sont respectivement les gènes inhibiteurs de l'apoptose et les gènes promoteurs de l'apoptose les plus représentatifs de la famille des protéines Bcl-2. La protéine Bax codée par le gène Bax peut former des hétérodimères avec Bcl-2, inhibant l'expression de Bcl-2. Les recherches ont montré que le rapport entre les protéines Bax et Bcl-2 est un facteur clé qui détermine la force de l'inhibition de l'apoptose cellulaire, et que Bax/Bcl-2 peut également être considéré comme un interrupteur moléculaire de l'apoptose. Le mécanisme de l'apoptose cellulaire induite par le Bax est que le Bax pénètre dans les mitochondries sous l'action du tBid, augmente la perméabilité de la membrane mitochondriale et libère ensuite le cytochrome C. La libération du cytochrome C est une étape clé de la voie endogène de l'apoptose cellulaire, qui se produit en ciblant et en activant la Caspase-9, conduisant à l'activation des caspases effectrices (telles que la Caspase-3). Par conséquent, cette étude a examiné l'effet protecteur du MIP-16 sur l'apoptose cellulaire induite par la 6-OHDA en détectant les niveaux d'expression de Bcl-2 et de Bax, ainsi que l'activité de la Caspase (Caspase-3 et Caspase-9). Nos recherches nous ont permis de constater que le prétraitement de la 6-OHDA par le MIP-16 augmentait de manière significative les niveaux de Bcl-2 et diminuait les niveaux de Bax, tout en inhibant l'activité de la Caspase-3 et de la Caspase-9. Ces résultats suggèrent que le MIP-16 pourrait exercer des effets antiapoptotiques en régulant le rapport Bcl-2/Bax et en inhibant l'activité de la Caspase-3/-9.
Les résultats de la recherche indiquent que le MIP-16 a un effet inhibiteur significatif sur l'apoptose induite par le 6-OHDA dans les cellules PC12 : il remodèle l'activité des enzymes antioxydantes endogènes, notamment la SOD, la CAT et la GSH Px, en tant que promoteur des antioxydants endogènes. Réduire les niveaux de ROS et la production de MDA, diminuant ainsi les niveaux d'oxydation cellulaire et inhibant l'initiation de l'apoptose. Réguler le rapport Bax/BCl-2, inhiber l'expression de la Caspase-9 et de la Caspase-3, bloquant ainsi la voie de l'apoptose mitochondriale dans les cellules. Le MIP-16 a une structure simple et est facile à synthétiser artificiellement. Il devrait être développé et utilisé comme médicament pour atténuer et faciliter le traitement de la maladie de Parkinson.