Reinigung und neuroprotektive Aktivität von MIP-16, einem Peptid aus Morchella edulis
Die Parkinson-Krankheit (PD) ist die zweithäufigste neurodegenerative Erkrankung beim Menschen, mit einer Prävalenzrate von 2% bis 3% bei Personen über 65 Jahren. Die pathologischen Merkmale der Parkinson-Krankheit lassen sich als Verlust einer großen Anzahl dopaminerger Neuronen in der Substantia nigra pars compacta zusammenfassen, was zu einem Rückgang der Dopamin-Biosynthese in der Substantia nigra und im Striatum führt. Der Pathogenese-Mechanismus von Morbus Parkinson ist noch nicht geklärt. Studien haben bestätigt, dass Umweltfaktoren, genetische Faktoren, oxidativer Stress und andere Faktoren an der Degeneration und dem Absterben der dopaminergen Neuronen bei Morbus Parkinson beteiligt sein können. Unter ihnen ist der oxidative Stress eine wichtige Ursache für die neuronale Degeneration und das Absterben. Einerseits ist das Gehirn das Organ mit dem höchsten Sauerstoffverbrauch bei normalen physiologischen Aktivitäten des Menschen, aber der relative Mangel an antioxidativen Enzymen im Gehirn macht es sehr anfällig für Schäden durch oxidativen Stress; Andererseits haben frühe Studien gezeigt, dass ein Anstieg des mitochondrialen oxidativen Stresses in dopaminergen Neuronen in der Substantia nigra pars compacta eine dopaminabhängige toxische Kaskade auslösen kann, die zu einer lysosomalen Dysfunktion und einer Anhäufung von Alpha-Synuclein führt, den beiden wichtigsten pathologischen Merkmalen der Parkinsonschen Krankheit. Gegenwärtig wird in der Medizin zur Behandlung der Parkinson-Krankheit meist eine klassische Dopamin-Ersatztherapie eingesetzt, z. B. die Supplementierung von L-3,4-Dihydroxyphenylalanin (L-DOPA). Immer mehr Studien haben jedoch ergeben, dass diese klassische Therapie erhebliche Nebenwirkungen hat. Klinische Beobachtungen haben ergeben, dass eine Langzeitbehandlung mit L-DOPA bei Parkinson-Patienten mit einer gewissen Wahrscheinlichkeit zu Bewegungsstörungen führen kann. Daher ist die Reduzierung des oxidativen Stresses und die Suche nach neuen neuroprotektiven Wirkstoffen einer der möglichen Wege zur Vorbeugung und Behandlung von Parkinson.
In den letzten Jahren wurde der Gewinnung und Reinigung von neuroprotektiven Wirkstoffen mit antioxidativer Wirkung aus Naturprodukten große Aufmerksamkeit geschenkt, und es wurden bedeutende Fortschritte erzielt. Das aus den Wurzeln von Rhodiola rosea L., einer Pflanze aus der Familie der Sedaceae, extrahierte Salidrosid kann oxidativen Stress und Entzündungen hemmen und so apoptotische PC12-Zellen schützen. Paeoniflorin mildert die durch 6-Hydroxydopamin induzierte Apoptose in PC12-Zellen, indem es die Aktivierung von NF-κ B hemmt. Im Vergleich zu Pflanzen gibt es jedoch relativ wenig Forschung zu neuroprotektiven Wirkstoffen aus Pilzen. Einige Pilzpolysaccharide können eine gute Fängeraktivität für freie Radikale aufweisen und neuroprotektive Wirkungen entfalten. Pilzpolysaccharide haben jedoch ein großes Molekulargewicht, eine komplexe Struktur und können die Blut-Hirn-Schranke nur schwer durchdringen, was ihre Anwendung als neuroprotektive Wirkstoffe einschränkt. Die Ethanol- oder Wasserextrakte bestimmter Pilze enthalten neuroprotektive Faktoren, aber die Zusammensetzung der Extrakte ist noch unklar und die Struktur der funktionellen Substanzen muss noch ermittelt werden.
Morchella spp. ist ein wertvoller Speise- und Heilpilz, der im Compendium of Materia Medica als "süß und kalt, ungiftig, schleimlösend und Qi regulierend und wohltuend für den Magen-Darm-Trakt" beschrieben wird. Morchella importuna M. Kuo. ist eine in China weit verbreitete Sorte. In unserer früheren Forschung wurde bestätigt, dass der Wasserextrakt von Morchella importuna eine Substanz enthält, die dem Nervenwachstumsfaktor (NGF) ähnelt, der die Differenzierung von PC12-Zellen und die Bildung neuronaler Netzwerke fördern kann. Darauf aufbauend wurden in dieser Studie die funktionellen Komponenten im Fruchtkörper von Morchella prolifera weiter gereinigt und identifiziert, ein PC12-Zellmodell konstruiert, das durch 6-OHDA geschädigt wurde, die neuroprotektive Aktivität der funktionellen Komponenten im Fruchtkörper von Morchella prolifera verifiziert, Daten für die Entwicklung der gesundheitlichen Vorteile von künstlich kultivierten Morchella prolifera bereitgestellt und alternative Ressourcen für das Screening von aus Pilzen gewonnenen neuroprotektiven Wirkstoffen bereitgestellt.

Einige Großpilze haben einen extrem hohen Lebensmittel- und medizinischen Wert und sind reich an Proteinen, was sie zu idealen Rohstoffen für die Gewinnung natürlicher Peptide macht. Cordymin ist ein aus Cordyceps sinensis extrahiertes Peptid, das Entzündungen hemmen und durch Ischämie und Hypoxie verursachte Hirnschäden bei Ratten lindern kann. Das aus dem Myzel von Pleurotus eryngii isolierte Peptid PEMP hat antioxidative, antitumorale und immunstärkende Funktionen. Derzeit konzentriert man sich bei der Erforschung der Wirkstoffe von Pilzen hauptsächlich auf die Polysaccharide. Im Vergleich zu den Polysacchariden von Pilzen haben Peptide eine einfache Struktur, eine geringe Immunogenität und lassen sich leicht künstlich herstellen, was sie zu einem vielversprechenden Bestandteil der modernen Arzneimittelentwicklung macht. Gegenwärtig werden zur Trennung und Reinigung von Polypeptiden aus Proteinhydrolysaten häufig chromatographische Säulenverfahren eingesetzt, darunter Ionenaustauschchromatographie und/oder Gelfiltrationschromatographie. Erstere können nach der Ladung von Ionen und polaren Molekülen getrennt werden, während letztere nach der Molekülgröße getrennt werden können. Derzeit gibt es jedoch keine Berichte über Standardmethoden zur Extraktion von Pilzpeptiden, und der pH-Wert des Extraktionspuffers sowie die Frage, ob während des Extraktionsprozesses eine Protease-Hydrolyse erforderlich ist, wurden nicht untersucht. Darüber hinaus entspricht die Extraktion von Peptiden aus verschiedenen Pilzarten oft unterschiedlichen Extraktionsmethoden, was für die Förderung und Anwendung von Pilzpeptiden nicht förderlich ist. Verglichen mit der Standardextraktionsmethode für die Pilzpolysaccharidreife muss die Extraktionsmethode für Pilzpeptide weiter erforscht werden. In dieser Studie wurde MIP-16 mit einer Kombination aus Molekularausschlusschromatographie und reverser Hochleistungsflüssigkeitschromatographie gereinigt. Bei dieser Methode wurden die Moleküle zunächst grob nach ihrer Größe aufgeteilt und dann nach ihrer Polarität unterteilt. Das Experiment hat gezeigt, dass diese Methode eine gute Unterscheidungsfähigkeit besitzt, aber die erforderliche Versuchszeit ist relativ lang und muss weiter verbessert werden.
Die Degeneration und der Zelltod dopaminerger Neuronen in der Substantia nigra striatum führen zu Dopaminmangel, der die Hauptursache der Parkinson-Krankheit ist. Daher ist die Dopamin-Ersatztherapie (z. B. die Gabe von L-DOPA) derzeit eine der besten Methoden zur Behandlung der idiopathischen Parkinson-Krankheit, bei der die Symptome durch die Zufuhr von exogenem Dopamin gelindert werden. Nach dem anfänglichen optimalen Ansprechen auf die Behandlung geht eine Langzeitbehandlung mit L-DOPA jedoch häufig mit Nebenwirkungen wie dem Verlust der motorischen Funktion einher. Darüber hinaus haben Wissenschaftler 6-OHDA im Urin von Parkinson-Patienten nachgewiesen, die über einen langen Zeitraum L-DOPA eingenommen haben. Daher haben wir in dieser Studie PC12-Zellen mit 6-OHDA behandelt, um das frühe Auftreten von Parkinson zu simulieren und nach neuen neuroprotektiven Wirkstoffen zu suchen. In unserer Studie stellten wir fest, dass die Behandlung mit 6-OHDA die ROS-Konzentration in PC12-Zellen erhöht, was wiederum die Apoptose der Zellen auslöst. Wir vermuten, dass eine langfristige L-DOPA-Behandlung mehr 6-OHDA produziert, was einen negativen Rückkopplungseffekt auf die Behandlung von Parkinson haben könnte. Auf der Grundlage der obigen Analyse wird erwartet, dass ausgehend von der Verringerung des oxidativen Drucks und der Minimierung der oxidativen Schäden nach effizienten und sicheren neuroprotektiven Wirkstoffen gesucht wird. Die in höheren Pilzen enthaltenen Polysaccharide, Peptide, Triterpene und andere Komponenten haben eine gute antioxidative Wirkung. Daher suchen wir nach neuroprotektiven Wirkstoffen aus Pilzen, um Ressourcen für das Wirkstoffscreening bei Parkinson bereitzustellen.
Oxidationsreaktionen können Energie für die Aktivitäten des menschlichen Lebens liefern, aber die bei der Reaktion entstehenden Superoxidanion-Radikale und Hydroxylradikale können oxidative Schäden verursachen. Das Vorhandensein körpereigener antioxidativer Enzyme und anderer Antioxidantien sorgt für ein Gleichgewicht zwischen der Produktion und dem Verbrauch von ROS, so dass unter normalen Bedingungen ein stabiler Zustand aufrechterhalten wird. Studien haben jedoch ergeben, dass mit zunehmendem Alter die Effizienz des antioxidativen Systems allmählich abnimmt. Bei älteren Menschen übersteigt die Zunahme reaktiver Sauerstoffspezies die Abbaukapazität des antioxidativen Systems, was zu oxidativem Stress führt und möglicherweise neurodegenerative Erkrankungen wie die Parkinson-Krankheit verursacht. Endogene antioxidative Enzyme, darunter Superoxiddismutase (SOD), Katalase (CAT), Glutathionperoxidase (GSH Px) usw., sind das natürliche Abwehrsystem des Körpers gegen oxidativen Stress. Nach der Behandlung mit 6-OHDA nahm die Aktivität der intrazellulären antioxidativen Enzyme deutlich ab. Daraus lässt sich schließen, dass zu diesem Zeitpunkt das intrazelluläre antioxidative Enzymsystem die normale Belastung deutlich übersteigt. Eine 6-stündige Vorbehandlung mit MIP-16 erhöhte die endogene antioxidative Enzymaktivität in PC12-Zellen signifikant. Der SOD-Spiegel spiegelt die Belastung des intrazellulären antioxidativen Enzymsystems und indirekt den Gehalt an intrazellulären freien Radikalen wider. Dieses Ergebnis könnte darauf hinweisen, dass die Bildung von anionischem Superoxid nach der MIP-16-Vorbehandlung reduziert wurde. Darüber hinaus ist GSH Px eine Kernkomponente der zellulären antioxidativen Abwehr und ein Elektronendonator für ROS, was darauf hindeutet, dass MIP-16 als weiteres Entgiftungssystem den GSH-Stoffwechsel beeinflussen und den durch 6-OHDA induzierten Zelltod verhindern könnte.
Wenn das körpereigene antioxidative Enzymsystem nicht in der Lage ist, ROS rechtzeitig zu beseitigen, können ROS leicht Biomoleküle schädigen, was letztlich zur Apoptose der Zellen führt. Bcl-2 und Bax sind die repräsentativsten apoptosehemmenden Gene bzw. apoptosefördernden Gene der Bcl-2-Proteinfamilie. Das vom Bax-Gen kodierte Bax-Protein kann Heterodimere mit Bcl-2 bilden und so die Expression von Bcl-2 hemmen. Die Forschung hat herausgefunden, dass das Verhältnis von Bax/Bcl-2-Proteinen ein Schlüsselfaktor ist, der die Stärke der Zellapoptosehemmung bestimmt, und Bax/Bcl-2 kann auch als molekularer Schalter für die Apoptose angesehen werden. Der Mechanismus der durch Bax induzierten Zellapoptose besteht darin, dass Bax unter der Wirkung von tBid in die Mitochondrien eindringt, die Permeabilität der Mitochondrienmembran erhöht und dann Cytochrom C freisetzt. Die Freisetzung von Cytochrom C ist ein wichtiger Schritt im endogenen Weg der Zellapoptose, der durch die Ausrichtung und Aktivierung von Caspase-9 erfolgt und zur Aktivierung von Effektor-Caspasen (wie Caspase-3) führt. Daher wurde in dieser Studie die schützende Wirkung von MIP-16 auf die durch 6-OHDA induzierte Zellapoptose untersucht, indem die Expressionsniveaus von Bcl-2 und Bax sowie die Aktivität von Caspase (Caspase-3 und Caspase-9) ermittelt wurden. Bei unseren Untersuchungen stellten wir fest, dass die Vorbehandlung von 6-OHDA mit MIP-16 die Bcl-2-Werte signifikant erhöhte und die Bax-Werte verringerte, während die Aktivität von Caspase-3 und Caspase-9 gehemmt wurde. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass MIP-16 durch die Regulierung des Bcl-2/Bax-Verhältnisses und die Hemmung der Caspase-3/-9-Aktivität anti-apoptotische Wirkungen ausüben kann.
Die Forschungsergebnisse deuten darauf hin, dass MIP-16 eine signifikante hemmende Wirkung auf die durch 6-OHDA induzierte Apoptose in PC12-Zellen hat: Umformung der Aktivität endogener antioxidativer Enzyme, einschließlich SOD, CAT und GSH Px, als endogener antioxidativer Promotor. Verringerung der ROS-Werte und der MDA-Produktion, wodurch die zellulären Oxidationswerte gesenkt und die Einleitung der Apoptose gehemmt werden. Regulierung des Bax/BCl-2-Verhältnisses, Hemmung der Expression von Caspase-9 und Caspase-3 und damit Blockierung des mitochondrialen Apoptosewegs in den Zellen. MIP-16 hat eine einfache Struktur und lässt sich leicht künstlich herstellen. Es wird erwartet, dass es als Medikament zur Linderung und Unterstützung der Behandlung von Parkinson entwickelt und eingesetzt werden kann.