Oprensning og neurobeskyttende aktivitet af MIP-16, et peptid fra Morchella edulis
Parkinsons sygdom (PD) er den næststørste neurodegenerative sygdom hos mennesker med en prævalens på 2% til 3% blandt personer på 65 år og derover. De patologiske karakteristika ved PD kan sammenfattes som tabet af et stort antal dopaminerge neuroner i substantia nigra pars compacta, hvilket fører til et fald i dopaminbiosyntesen i substantia nigra og striatum. Den patogene mekanisme bag PD er endnu ikke klarlagt. Undersøgelser har bekræftet, at miljøfaktorer, genetiske faktorer, oxidativ stress og andre faktorer kan være involveret i degeneration og død af dopaminerge neuroner ved PD. Blandt dem er oxidativ stress en vigtig årsag til neuronal degeneration og degeneration. På den ene side er hjernen det organ, der har det højeste iltforbrug i normale fysiologiske aktiviteter hos mennesker, men den relative mangel på antioxidantenzymer i hjernen gør den meget modtagelig for oxidativ stressskade; På den anden side har tidlige undersøgelser vist, at en stigning i mitokondrielt oxidativt stress i dopaminerge neuroner i substantia nigra pars compacta kan udløse en dopaminafhængig toksisk kaskade, der fører til lysosomal dysfunktion og ophobning af alfa-synuclein, som er de to vigtigste patologiske træk ved Parkinsons sygdom. På nuværende tidspunkt bruges klassisk dopaminerstatningsterapi mest i medicin til behandling af PD, f.eks. tilskud af L-3,4-dihydroxyphenylalanin (L-DOPA). Men flere og flere undersøgelser har vist, at denne klassiske behandling har betydelige bivirkninger. Kliniske observationer har vist, at langvarig L-DOPA-behandling har en vis sandsynlighed for at forårsage bevægelsesforstyrrelser hos PD-patienter. Derfor er en af de potentielle måder at forebygge og behandle PD på at starte med at reducere oxidativt stress og søge nye neurobeskyttende midler.
I de senere år har udvinding og oprensning af neurobeskyttende stoffer med antioxidantaktivitet fra naturlige produkter fået stor opmærksomhed, og der er gjort betydelige fremskridt. Salidrosid udvundet fra rødderne af Rhodiola rosea L., en plante i Sedaceae-familien, kan hæmme oxidativ stress og inflammation for at beskytte apoptotiske PC12-celler. Paeoniflorin lindrer 6-hydroxydopamin-induceret apoptose i PC12-celler ved at hæmme aktiveringen af NF - κ B. Sammenlignet med planter er der dog relativt mindre forskning i neuroprotektive midler fra svampe. Nogle svampepolysaccharider kan udvise god aktivitet til fjernelse af frie radikaler og udøve neurobeskyttende virkninger. Svampepolysaccharider har dog en stor molekylvægt, kompleks struktur og er vanskelige at trænge igennem blod-hjerne-barrieren, hvilket begrænser deres anvendelse som neurobeskyttende midler. Ethanol- eller vandekstrakter af visse svampe indeholder neurobeskyttende faktorer, men sammensætningen af ekstrakterne er stadig uklar, og strukturen af de funktionelle stoffer skal identificeres.
Morchella spp. er en værdifuld spiselig og medicinsk svamp, som i Compendium of Materia Medica er registreret som "sød og kold, ugiftig, slimløsende og qi-regulerende og gavnlig for mave-tarmkanalen". Morchella importuna M. Kuo. er en meget dyrket sort i Kina. I vores tidligere forskning blev det bekræftet, at vandekstraktet af Morchella importuna indeholder et stof, der ligner nervevækstfaktor (NGF), som kan fremme differentieringen af PC12-celler og danne neurale netværk. På baggrund af dette har vi i denne undersøgelse yderligere oprenset og identificeret de funktionelle komponenter i frugtlegemet af Morchella prolifera, konstrueret en PC12-cellemodel, der er beskadiget af 6-OHDA, verificeret den neurobeskyttende aktivitet af de funktionelle komponenter i frugtlegemet af Morchella prolifera, tilvejebragt data til udvikling af de sundhedsmæssige fordele ved kunstigt dyrket Morchella prolifera og tilvejebragt alternative ressourcer til screening af neurobeskyttende midler, der stammer fra svampe.

Nogle store svampe har ekstremt høj fødevare- og medicinsk værdi og er rige på protein, hvilket gør dem til ideelle råmaterialer til fremstilling af naturlige peptider. Cordymin er et peptid udvundet af Cordyceps sinensis, som kan hæmme inflammation og lindre hjerneskade forårsaget af iskæmi og hypoxi hos rotter. Peptidet PEMP, der er isoleret fra myceliet af Pleurotus eryngii, har antioxidant-, antitumor- og immunforstærkende funktioner. På nuværende tidspunkt er de aktive ingredienser i svampe hovedsageligt fokuseret på forskning i polysaccharider. Sammenlignet med svampepolysaccharider har peptider en enkel struktur, lav immunogenicitet og er nemme at syntetisere kunstigt, hvilket gør dem til en meget lovende del af den moderne lægemiddeludvikling. På nuværende tidspunkt bruges der ofte kromatografiske søjlemetoder til at adskille og rense polypeptider fra proteinhydrolysater, herunder ionbytningskromatografi og/eller gelfiltreringskromatografi. Førstnævnte kan adskilles i henhold til ladningen af ioner og polære molekyler, mens sidstnævnte kan adskilles i henhold til molekylstørrelsen. Der er dog i øjeblikket ingen rapporter om standardmetoder til ekstraktion af svampepeptider, og pH-værdien i ekstraktionsbufferen, og om proteasehydrolyse er påkrævet under ekstraktionsprocessen, er ikke blevet udforsket. Desuden svarer udvinding af peptider fra forskellige typer svampe ofte til forskellige udvindingsmetoder, hvilket ikke er befordrende for fremme og anvendelse af svampepeptider. Sammenlignet med standardekstraktionsmetoden for svampepolysaccharidmodning er der behov for yderligere udforskning af ekstraktionsmetoden for svampepeptider. I denne undersøgelse blev MIP-16 oprenset ved hjælp af en kombination af molekylær eksklusionskromatografi og omvendt højtydende væskekromatografi. Metoden opdelte først molekylerne groft ud fra deres størrelse og underopdelte dem derefter ud fra deres polaritet. Eksperimentet viste, at denne metode har god skelneevne, men den krævede eksperimentelle tid er relativt lang, og der er behov for yderligere forbedringer.
Degeneration og celledød af dopaminerge neuroner i substantia nigra striatum fører til dopaminmangel, som er den vigtigste årsag til Parkinsons sygdom. Derfor er dopaminerstatningsterapi (som f.eks. tilskud af L-DOPA) i øjeblikket en af de bedste metoder til behandling af idiopatisk Parkinsons sygdom, som lindrer symptomerne gennem tilskud af eksogent dopamin. Men efter den første optimale behandlingsperiode medfører langvarig L-DOPA-behandling ofte bivirkninger som f.eks. tab af motorisk funktion. Desuden har forskere påvist 6-OHDA i urinen hos patienter med Parkinsons sygdom, der har taget L-DOPA i lang tid. Derfor behandlede vi i denne undersøgelse PC12-celler med 6-OHDA for at simulere den tidlige forekomst af PD og søge efter nye neurobeskyttende midler. I vores undersøgelse fandt vi, at behandling med 6-OHDA øger niveauet af ROS i PC12-celler, hvilket igen udløser celleapoptose. Vi spekulerer i, at langvarig L-DOPA-behandling kan producere mere 6-OHDA, hvilket kan have en negativ feedback-regulerende effekt på behandlingen af PD. Baseret på ovenstående analyse forventes det at screene for effektive og sikre neurobeskyttende midler ud fra reduktion af oxidativt tryk og minimering af oxidativ skade. Og polysaccharider, peptider, triterpener og andre komponenter i højere svampe har god antioxidantaktivitet. Derfor søger vi efter neurobeskyttende stoffer fra svampe for at skaffe ressourcer til screening af lægemidler til PD.
Oxidationsreaktioner kan give energi til menneskets livsaktiviteter, men de superoxidanionradikaler og hydroxylradikaler, der genereres under reaktionen, kan forårsage oxidativ skade. Tilstedeværelsen af endogene antioxidantenzymer og andre antioxidanter har en tendens til at afbalancere produktionen og forbruget af ROS og opretholde en stabil tilstand under normale forhold. Undersøgelser har dog vist, at antioxidantsystemets effektivitet gradvist falder med alderen. Hos ældre overstiger stigningen i reaktive iltarter antioxidantsystemets clearancekapacitet, hvilket fører til oxidativ stress og potentielt kan forårsage neurodegenerative sygdomme som Parkinsons sygdom. Endogene antioxidantenzymer, herunder superoxiddismutase (SOD), katalase (CAT), glutathionperoxidase (GSH Px) osv. er kroppens naturlige forsvarssystem mod oxidativ stress. Efter behandling med 6-OHDA faldt den intracellulære antioxidante enzymaktivitet markant. Det kan udledes, at det intracellulære antioxidantenzymsystem på dette tidspunkt væsentligt overstiger den normale belastning. Forbehandling med MIP-16 i 6 timer øgede signifikant den endogene antioxidante enzymaktivitet i PC12-celler. SOD-niveauer afspejler belastningen af det intracellulære antioxidantenzymsystem og afspejler indirekte niveauet af intracellulære frie radikaler. Dette resultat kan tyde på, at dannelsen af anionisk superoxid blev reduceret efter forbehandling med MIP-16. Desuden er GSH Px en kernekomponent i det cellulære antioxidantforsvar og en elektrondonor for ROS, hvilket tyder på, at MIP-16, som et andet afgiftningssystem, kan påvirke GSH-metabolismen og undgå 6-OHDA-induceret celledød.
Når det endogene antioxidante enzymsystem ikke kan fjerne ROS i tide, kan ROS let skade biomolekyler og i sidste ende føre til celleapoptose. Bcl-2 og Bax er de mest repræsentative apoptosehæmmende gener og apoptosefremmende gener i henholdsvis Bcl-2-proteinfamilien. Bax-proteinet, der kodes af Bax-genet, kan danne heterodimerer med Bcl-2 og hæmme udtrykket af Bcl-2. Forskning har vist, at forholdet mellem Bax/Bcl-2-proteiner er en nøglefaktor, der bestemmer styrken af celleapoptosehæmning, og Bax/Bcl-2 kan også betragtes som en molekylær switch for apoptose. Mekanismen for Bax-induceret celleapoptose er, at Bax kommer ind i mitokondrier under påvirkning af tBid, øger mitokondriemembranens permeabilitet og derefter frigiver cytokrom C. Frigivelsen af cytokrom C er et vigtigt trin i den endogene vej til celleapoptose, som opstår ved at målrette og aktivere Caspase-9, hvilket fører til aktivering af effektorcaspaser (såsom Caspase-3). Derfor undersøgte denne undersøgelse den beskyttende virkning af MIP-16 på 6-OHDA-induceret celleapoptose ved at detektere ekspressionsniveauerne af Bcl-2 og Bax samt aktiviteten af Caspase (Caspase-3 og Caspase-9). Fra vores forskning observerede vi, at forbehandling af 6-OHDA med MIP-16 signifikant øgede Bcl-2-niveauer og reducerede Bax-niveauer, mens de hæmmede Caspase-3 og Caspase-9-aktivitet. Disse resultater tyder på, at MIP-16 kan udøve antiapoptotiske virkninger ved at regulere Bcl-2/Bax-forholdet og hæmme Caspase-3/-9-aktiviteten.
Forskningsresultaterne indikerer, at MIP-16 har en signifikant hæmmende effekt på 6-OHDA-induceret apoptose i PC12-celler: omformning af endogen antioxidant enzymaktivitet, herunder SOD, CAT og GSH Px, som en endogen antioxidantpromotor. Reducerer ROS-niveauer og MDA-produktion og sænker derved cellulære oxidationsniveauer og hæmmer initieringen af apoptose. Regulere Bax/BCl-2-forholdet, hæmme ekspressionen af Caspase-9 og Caspase-3 og derved blokere den mitokondrielle apoptosevej i celler. MIP-16 har en enkel struktur og er let at syntetisere kunstigt, hvilket forventes at blive udviklet og brugt som et lægemiddel til at lindre og hjælpe med behandlingen af PD.