A Morchella edulisból származó MIP-16 peptid tisztítása és neuroprotektív aktivitása
A Parkinson-kór (Parkinson-kór) a második leggyakoribb neurodegeneratív betegség az emberekben, a 65 éves és idősebb egyének körében 2%-3% közötti gyakorisággal. A Parkinson-kór patológiai jellemzői a substantia nigra pars compacta nagyszámú dopaminerg neuronjának elvesztésében foglalhatók össze, ami a substantia nigra és a striatum dopamin-bioszintézisének csökkenéséhez vezet. A Parkinson-kór patogenetikai mechanizmusa még nem tisztázott. Vizsgálatok megerősítették, hogy környezeti tényezők, genetikai tényezők, oxidatív stressz és más tényezők is szerepet játszhatnak a PD-ben a dopaminerg neuronok degenerációjában és pusztulásában. Ezek közül az oxidatív stressz a neuronok degenerációjának és elfajulásának fontos oka. Egyrészt az agy az a szerv, amelynek a legnagyobb az oxigénfogyasztása az ember normális fiziológiai tevékenysége során, de az antioxidáns enzimek relatív hiánya az agyban nagyon érzékennyé teszi az oxidatív stressz okozta károsodásra; Másrészt korai vizsgálatok kimutatták, hogy a mitokondriális oxidatív stressz növekedése a substantia nigra pars compacta dopaminerg neuronjaiban dopaminfüggő toxikus kaszkádot indíthat el, ami lizoszomális diszfunkcióhoz és az alfa-szinuklein felhalmozódásához vezet, ami a Parkinson-kór két fő patológiai jellemzője. Jelenleg az orvostudományban a Parkinson-kór kezelésére leginkább a klasszikus dopaminpótló terápiát alkalmazzák, például az L-3,4-dihidroxi-fenilalanin (L-DOPA) pótlását. Azonban egyre több tanulmány állapította meg, hogy ennek a klasszikus terápiának jelentős mellékhatásai vannak. Klinikai megfigyelések szerint a hosszú távú L-DOPA kezelés bizonyos valószínűséggel mozgásszervi zavarokat okoz a Parkinson-kóros betegeknél. Ezért az oxidatív stressz csökkentéséből kiindulva és új neuroprotektív szereket keresve a PD megelőzésének és kezelésének egyik lehetséges módja.
Az elmúlt években széles körű figyelmet kapott az antioxidáns hatású neuroprotektív hatóanyagok természetes termékekből történő kivonása és tisztítása, és jelentős előrelépés történt. A Sedaceae családba tartozó Rhodiola rosea L. növény gyökeréből kivont szalidrozid képes gátolni az oxidatív stresszt és a gyulladást az apoptotikus PC12 sejtek védelme érdekében. A paeoniflorin enyhíti a 6-hidroxidopamin által kiváltott apoptózist a PC12 sejtekben az NF - κ B aktivációjának gátlásával. A növényekhez képest azonban viszonylag kevesebb kutatás van a gombák neuroprotektív hatóanyagaival kapcsolatban. Egyes gombapoliszacharidok jó szabadgyökfogó aktivitást mutatnak és neuroprotektív hatást fejtenek ki. A gombapoliszacharidok azonban nagy molekulatömegűek, összetett szerkezetűek, és nehezen hatolnak át a vér-agy gáton, ami korlátozza alkalmazásukat neuroprotektív hatóanyagként. Egyes gombák etanolos vagy vizes kivonata neuroprotektív faktorokat tartalmaz, de a kivonatok összetétele még mindig nem világos, és a funkcionális anyagok szerkezetét még azonosítani kell.
A Morchella spp. egy értékes ehető és gyógyászati gomba, amelyet a Compendium of Materia Medica "édes és hideg, nem mérgező, flegmaoldó és qi szabályozó, valamint a gyomor-bélrendszerre jótékonyan ható" néven jegyez. A Morchella importuna M. Kuo. széles körben termesztett fajta Kínában. Korábbi kutatásainkban megerősítést nyert, hogy a Morchella importuna vizes kivonata tartalmaz egy, az idegnövekedési faktorhoz (NGF) hasonló anyagot, amely elősegítheti a PC12 sejtek differenciálódását és az ideghálózatok kialakulását. Ennek alapján ez a tanulmány tovább tisztította és azonosította a Morchella prolifera termőtestében lévő funkcionális komponenseket, felépített egy 6-OHDA által károsított PC12 sejtmodellt, igazolta a Morchella prolifera termőtestében lévő funkcionális komponensek neuroprotektív aktivitását, adatokat szolgáltatott a mesterségesen termesztett Morchella prolifera egészségügyi előnyeinek fejlesztéséhez, és alternatív forrásokat biztosított a gombából származó neuroprotektív szerek szűréséhez.

Egyes nagy gombák rendkívül magas élelmiszer- és gyógyászati értékkel rendelkeznek, és fehérjében gazdagok, így ideális alapanyagok a természetes peptidek előállításához. A Cordymin a Cordyceps sinensisből kivont peptid, amely képes gátolni a gyulladást és enyhíteni az iszkémia és hipoxia által okozott agykárosodást patkányokban. A Pleurotus eryngii micéliumából izolált PEMP peptid antioxidáns, tumorellenes és immunerősítő funkcióval rendelkezik. Jelenleg a gombák hatóanyagai elsősorban a poliszacharidok kutatására összpontosítanak. A gombák poliszacharidjaival összehasonlítva a peptidek egyszerű szerkezetűek, alacsony immunogenitásúak és könnyen szintetizálhatók mesterségesen, így a modern gyógyszerfejlesztés rendkívül ígéretes részét képezik. Jelenleg gyakran alkalmaznak kromatográfiás oszlopos módszereket a polipeptidek fehérjehidrolizátumokból történő elválasztására és tisztítására, beleértve az ioncserélő kromatográfiát és/vagy a gélszűrő kromatográfiát. Az előbbiekkel az ionok és a poláris molekulák töltése szerint, míg az utóbbiakkal a molekulatömeg szerint lehet elválasztani. Jelenleg azonban nincsenek jelentések a gombapeptidek extrakciójának standard módszereiről, és nem vizsgálták az extrakciós puffer pH-értékét, valamint azt, hogy szükséges-e proteáz-hidrolízis az extrakciós folyamat során. Ezenkívül a különböző gombafajokból származó peptidek kivonása gyakran eltérő extrakciós módszereknek felel meg, ami nem kedvez a gombapeptidek promóciójának és alkalmazásának. A gombák poliszacharid érettségének standard extrakciós módszerével összehasonlítva, a gombapeptidek extrakciós módszerének további feltárása szükséges. Ebben a tanulmányban a MIP-16-ot molekuláris kizárásos kromatográfia és fordított nagy teljesítményű folyadékkromatográfia kombinációjával tisztítottuk. A módszer először durván felosztotta a molekulákat méretük alapján, majd polaritásuk alapján alábontotta őket. A kísérlet bebizonyította, hogy ez a módszer jó megkülönböztető képességgel rendelkezik, de a szükséges kísérleti idő viszonylag hosszú, és további fejlesztésre van szükség.
A substantia nigra striatumban lévő dopaminerg neuronok degenerációja és sejthalála dopaminhiányhoz vezet, ami a Parkinson-kór fő oka. Ezért a dopaminpótló terápia (például az L-DOPA pótlása) jelenleg az egyik legjobb módszer az idiopátiás Parkinson-kór kezelésére, amely az exogén dopamin pótlásával enyhíti a tüneteket. A kezdeti optimális kezelési válaszidőszak után azonban a hosszú távú L-DOPA-kezelés gyakran jár mellékhatásokkal, például a motoros funkciók elvesztésével. Emellett a tudósok 6-OHDA-t mutattak ki olyan Parkinson-kóros betegek vizeletében, akik hosszú ideig L-DOPA-t szedtek. Ezért ebben a tanulmányban PC12 sejteket kezeltünk 6-OHDA-val, hogy szimuláljuk a Parkinson-kór korai előfordulását és új neuroprotektív szereket keressünk. Tanulmányunkban azt találtuk, hogy a 6-OHDA-val történő kezelés növeli a ROS szintjét a PC12 sejtekben, ami viszont sejt apoptózist vált ki. Feltételezzük, hogy a hosszú távú L-DOPA kezelés több 6-OHDA-t termelhet, ami negatív visszacsatoló szabályozó hatással lehet a PD kezelésére. A fenti elemzés alapján az oxidatív nyomás csökkentéséből és az oxidatív károsodás minimalizálásából kiindulva várhatóan hatékony és biztonságos neuroprotektív szerek szűrése. A magasabb gombákban található poliszacharidok, peptidek, triterpének és egyéb komponensek pedig jó antioxidáns aktivitással rendelkeznek. Ezért keressük a gombákból származó neuroprotektív hatóanyagokat, hogy forrásokat biztosítsunk a PD-ben alkalmazott gyógyszerek szűréséhez.
Az oxidációs reakciók energiát biztosíthatnak az emberi élettevékenységekhez, de a reakció során keletkező szuperoxid-anion gyökök és hidroxilgyökök oxidatív károsodást okozhatnak. Az endogén antioxidáns enzimek és más antioxidánsok jelenléte hajlamos egyensúlyt teremteni a ROS termelődésében és fogyasztásában, fenntartva az egyensúlyi állapotot normál körülmények között. A vizsgálatok azonban azt találták, hogy az életkor növekedésével az antioxidáns rendszer hatékonysága fokozatosan csökken. Az időseknél a reaktív oxigénfajok növekedése meghaladja az antioxidáns rendszer tisztító kapacitását, ami oxidatív stresszhez vezet, és potenciálisan neurodegeneratív betegségeket, például Parkinson-kórt okozhat. Az endogén antioxidáns enzimek, beleértve a szuperoxid-dizmutázt (SOD), a katalázt (CAT), a glutation-peroxidázt (GSH Px) stb. a szervezet természetes védelmi rendszere az oxidatív stresszel szemben. A 6-OHDA-val történő kezelés után az intracelluláris antioxidáns enzimaktivitás jelentősen csökkent. Ebből arra lehet következtetni, hogy ilyenkor az intracelluláris antioxidáns enzimrendszer jelentősen meghaladja a normál terhelést. A MIP-16 6 órán át tartó előkezelés jelentősen növelte az endogén antioxidáns enzimaktivitást a PC12 sejtekben. A SOD-szintek tükrözik az intracelluláris antioxidáns enzimrendszer terhelését, és közvetve tükrözik az intracelluláris szabad gyökök szintjét. Ez az eredmény arra utalhat, hogy az anionos szuperoxid keletkezése csökkent a MIP-16 előkezelés után. Ezenkívül a GSH Px a sejtek antioxidáns védelmének egyik központi összetevője és a ROS elektrondonorja, ami arra utal, hogy a MIP-16, mint egy másik méregtelenítő rendszer, befolyásolhatja a GSH anyagcseréjét és elkerülheti a 6-OHDA által kiváltott sejthalált.
Ha az endogén antioxidáns enzimrendszer nem képes időben eltávolítani a ROS-t, a ROS könnyen károsíthatja a biomolekulákat, ami végül a sejtek apoptózisához vezet. A Bcl-2 és a Bax a Bcl-2 fehérjecsalád legreprezentatívabb apoptózist gátló, illetve apoptózist elősegítő génjei. A Bax gén által kódolt Bax fehérje heterodimert képezhet a Bcl-2-vel, gátolva a Bcl-2 expresszióját. A kutatások azt találták, hogy a Bax/Bcl-2 fehérjék aránya kulcsfontosságú tényező, amely meghatározza a sejt apoptózis gátlásának erősségét, és a Bax/Bcl-2 az apoptózis molekuláris kapcsolójának is tekinthető. A Bax által indukált sejt apoptózis mechanizmusa az, hogy a Bax a tBid hatására bejut a mitokondriumokba, növeli a mitokondriális membrán permeabilitását, majd citokróm C-t szabadít fel. A citokróm C felszabadulása kulcsfontosságú lépés a sejt apoptózis endogén útvonalában, amely a Caspase-9 célba juttatásával és aktiválásával történik, ami az effektor kaszpázok (pl. Caspase-3) aktiválásához vezet. Ezért ez a tanulmány a MIP-16 védő hatását vizsgálta a 6-OHDA által indukált sejt apoptózisra a Bcl-2 és a Bax expressziós szintjének, valamint a kaszpáz (kaszpáz-3 és kaszpáz-9) aktivitásának kimutatásával. Kutatásaink alapján megfigyeltük, hogy a 6-OHDA MIP-16-tal történő előkezelése jelentősen növelte a Bcl-2 szintjét és csökkentette a Bax szintjét, miközben gátolta a kaszpáz-3 és kaszpáz-9 aktivitását. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a MIP-16 a Bcl-2/Bax arány szabályozásával és a kaszpáz-3/-9 aktivitás gátlásával apoptózisellenes hatást fejthet ki.
A kutatási eredmények azt mutatják, hogy a MIP-16 jelentős gátló hatással van a 6-OHDA által indukált apoptózisra a PC12 sejtekben: az endogén antioxidáns enzimaktivitás, beleértve a SOD, CAT és GSH Px, mint endogén antioxidáns promóter átformálása. Csökkenti a ROS-szinteket és az MDA-termelődést, ezáltal csökkenti a sejtek oxidációs szintjét és gátolja az apoptózis beindulását. A Bax/BCl-2 arány szabályozása, a Caspase-9 és Caspase-3 expressziójának gátlása, ezáltal a mitokondriális apoptózis útvonalának blokkolása a sejtekben. A MIP-16 egyszerű szerkezetű és könnyen szintetizálható mesterségesen, amelyet várhatóan a Parkinson-kór enyhítésére és kezelésének segítésére szolgáló gyógyszerként fejlesztenek és használnak fel.