Préparation enzymatique et activité anti-cancer cervical de l'isothiocyanate de Chamagu

Ces dernières années, le taux d'incidence du cancer augmente rapidement en Chine, et la prévention et le traitement du cancer sont urgents. La recherche montre que l'augmentation de la consommation de légumes crucifères peut réduire efficacement le taux d'incidence du cancer. Les légumes du genre Brassicaceae contiennent une grande quantité de glucosinolates, également connus sous le nom de glucosinolates (GL). Lorsque les plantes sont endommagées mécaniquement, les GL peuvent être hydrolysés par leur propre myrosinase pour produire des isothiocyanates. Les isothiocyanates sont une classe de composés contenant des doubles liaisons conjuguées, dont la formule moléculaire est R-N=C=S (R représente différents types de groupes alkyles). Ces dernières années, les isothiocyanates sont devenus un point chaud de la recherche en raison de leur activité biologique exceptionnelle. La recherche a montré que les isothiocyanates ont diverses activités biologiques telles que la lutte contre les tumeurs et les bactéries, le piégeage des radicaux libres et la résistance aux agents pathogènes. Ils ont été développés et utilisés dans de nombreux domaines tels que les soins de santé, l'alimentation et l'agriculture.

Brassica rapa L., dont le nom scientifique est "navet", est une plante herbacée bisannuelle appartenant à la famille des Brassicaceae. Elle est principalement répartie dans le sud-ouest des monts Tianshan et le nord-ouest du Tarim au Xinjiang, et constitue un légume de spécialité locale communément consommé par les habitants de tous les groupes ethniques du Xinjiang. Des recherches ont montré que les racines de Chamagu contiennent d'abondants GL. Zhuang et al. ont utilisé la technologie de la chromatographie liquide à ultra-haut débit pour analyser les types et les teneurs en GL à différents stades de développement et dans différentes parties de la croissance (racines, tiges, feuilles) des navets du Xinjiang au cours de leur période de croissance nutritionnelle. Ils ont constaté qu'il existait certaines différences dans les types et les fractions de masse des glucosinolates au cours des différents stades de développement de la croissance nutritionnelle. Les différences dans les types et les teneurs en glucosinolates dans les plantes entraîneront des variations dans les types et les teneurs en isothiocyanates, ce qui se traduira par des activités biologiques différentes. Sun a signalé que les graines de Qiamagu contiennent quatre types d'isothiocyanates : l'isothiocyanate de phényle, l'isothiocyanate de tert-butyle, l'isothiocyanate d'isopropyle et l'isothiocyanate d'allyle.

À l'heure actuelle, la préparation des isothiocyanates fait principalement appel à la synthèse chimique et à l'hydrolyse enzymatique. L'hydrolyse enzymatique utilise le système glucosinolate myrosinase des plantes crucifères pour extraire les isothiocyanates, ce qui présente l'avantage d'une opération simple et d'un rendement relativement élevé. L'hydrolyse enzymatique est divisée en deux méthodes : la méthode de dégradation endogène de la myrosinase et la méthode de dégradation exogène de la myrosinase. En utilisant l'hydrolyse enzymatique endogène pour préparer les isothiocyanates, bien que le processus soit simple, la myrosinase endogène dans les plantes ne peut pas être entièrement libérée, ce qui entraîne une longue durée d'hydrolyse enzymatique et une faible efficacité. Ding a comparé la quantité d'isothiocyanates générés par la dégradation des GL par des enzymes endogènes et exogènes dans le colza et a constaté que la quantité d'isothiocyanates générés par la myrosinase exogène était 7,6 fois supérieure à celle de la myrosinase endogène. L'identification et l'analyse GC-MS ont montré que la myrosinase exogène avait une variété de produits de dégradation, une teneur relativement élevée et moins d'impuretés.

Cette étude a utilisé la racine de Chamagu comme matière première et la méthode de dégradation par myrosinase exogène pour préparer l'isothiocyanate de Chamagu (BRICe). Sur la base d'un criblage à facteur unique, la durée de l'hydrolyse enzymatique, la température, le pH et la concentration d'acide ascorbique ont été identifiés comme des facteurs d'influence significatifs. Une expérience orthogonale à quatre facteurs et trois niveaux a été utilisée pour optimiser le processus d'extraction. Enfin, sa composition chimique a été analysée par chromatographie en phase gazeuse et spectrométrie de masse (GC-MS), et l'effet anticancéreux de l'isothiocyanate a été étudié.

Le cancer est l'une des maladies malignes qui menacent la sécurité de la vie humaine. De nombreuses études épidémiologiques ont montré que la consommation d'une plus grande quantité de légumes crucifères peut réduire efficacement le risque de cancer. L'isothiocyanate est l'un des produits de l'hydrolyse enzymatique des légumes crucifères. La recherche a montré que les isothiocyanates peuvent activer les enzymes de phase II dans le corps humain, ce qui permet aux produits des réactions de phase I de se lier à l'acide glucuronique et au glutathion, favorisant ainsi l'élimination rapide des substances cancérigènes de l'organisme. Les isothiocyanates peuvent donc être utilisés comme inhibiteurs de cancer en médecine. Le qiamagu est une plante médicinale et comestible du Xinjiang, qui contient divers ingrédients actifs tels que des glucosinolates, des flavonoïdes, des isothiocyanates et des polysaccharides. Toutefois, le développement et l'utilisation des isothiocyanates de Qiamagu sont actuellement insuffisants. L'hydrolyse enzymatique est actuellement une méthode respectueuse de l'environnement pour l'extraction des isothiocyanates. En optimisant les conditions de l'hydrolyse enzymatique, il est possible non seulement de réduire la production d'autres métabolites secondaires, mais aussi d'accélérer le taux de production du produit cible, ce qui permet d'augmenter le rendement. Jang a préparé des isothiocyanates en utilisant la myrosinase endogène dans la famille des Brassicaceae. Bien que la méthode de l'enzyme endogène soit simple, la myrosinase des plantes ne peut pas être entièrement libérée, ce qui entraîne un long temps d'hydrolyse enzymatique et une faible efficacité. Par rapport aux enzymes endogènes, l'utilisation d'enzymes exogènes pour préparer des isothiocyanates permet de contrôler plus facilement les conditions d'hydrolyse enzymatique des enzymes exogènes, ce qui est bénéfique pour orienter les changements dans les types de produits d'hydrolyse enzymatique et augmenter la quantité de produits. Par conséquent, l'optimisation des conditions d'hydrolyse enzymatique externe est la clé de la préparation des isothiocyanates.

La formation des produits de l'hydrolyse enzymatique n'est pas seulement liée au type de glucosinolate, mais aussi au temps d'hydrolyse, à la température d'hydrolyse, au pH, à la pression et à la présence de Fe2+. Latt é a constaté que lorsque le pH de la solution est neutre, la formation d'isothiocyanates par les glucosinolates est favorable. Cependant, lorsque le pH est acide/alcalin, ou lorsque des protéines caractéristiques du soufre cyclique ou du Fe2+ sont présentes, les produits de l'hydrolyse enzymatique formeront une grande quantité de nitriles. Yang a utilisé la méthodologie de la surface de réponse pour analyser les facteurs du pH, de l'EDTA et de l'acide ascorbique, et a constaté que ces trois facteurs ont un impact significatif sur la quantité d'isothiocyanate extraite. Burmeister a découvert que l'acide ascorbique remplaçait la fonction de base catalytique dans le site actif de la myrosinase, présentant ainsi les propriétés catalytiques de la myrosinase. L'ajout d'une quantité appropriée d'acide ascorbique à du brocoli frais peut améliorer de manière significative l'activité de la myrosinase, augmentant ainsi la production d'isothiocyanates. Cette étude a utilisé la méthode de dégradation de la myrosinase exogène (dérivée des graines de moutarde blanche) pour préparer le BRIe. Les conditions d'hydrolyse enzymatique ont été optimisées par le biais d'expériences à facteur unique et orthogonales, et quatre facteurs ayant un impact significatif sur l'extraction des BRIe ont été sélectionnés : le temps d'hydrolyse enzymatique, la température d'hydrolyse enzymatique, la concentration d'acide ascorbique et le pH. Les conditions optimales d'hydrolyse enzymatique pour le BRIe ont été déterminées comme suit : ajout de 20 μ L de myrosinase, température de réaction de 70 ℃, temps de réaction de 3h, pH de 6,5, concentration d'acide ascorbique de 0,1mg/g, et poudre lyophilisée de GLs de 2g. Il est intéressant de noter que la température optimale d'hydrolyse enzymatique pour cette étude est de 70 ℃. Des rapports de recherche indiquent que la plage de température pour l'hydrolyse enzymatique des isothiocyanates végétaux du brocoli est de 20 à 60 ℃, la température optimale d'hydrolyse enzymatique étant de 40 ℃ ; la plage de température pour l'extraction des isothiocyanates des racines de wasabi est de 30 à 90 ℃, et la température optimale d'hydrolyse enzymatique est de 70 ℃. Par conséquent, la température optimale pour la myrosinase varie en fonction de l'espèce d'origine.

En général, les types d'isothiocyanates formés varient en fonction des conditions de l'hydrolyse enzymatique. Chen et al. ont utilisé l'hydrolyse enzymatique endogène pour identifier les produits de l'hydrolyse enzymatique dans le brocoli : isothiocyanate d'allyle, isothiocyanate d'isobutyle, isothiocyanate de 1-butényle, 4-méthylthionitrile, 5-méthylthiopentonitrile, 3-(méthylthio) propyl-isothiocyanate, etc, 5-méthylthiopentonitrile, 3-(méthylthio) propyl isothiocyanate, butyl isothiocyanate, thiocyanate de radis et sulforaphane de radis en utilisant la GC-MS, le sulforaphane de radis ayant la teneur la plus élevée. Yang a utilisé l'hydrolyse enzymatique exogène pour identifier les produits de l'hydrolyse enzymatique dans le brocoli comme l'isothiocyanate d'allyle, l'isothiocyanate de phényle, l'isothiocyanate de cyclopentyle, le phénylpropanonitrile, la 2,1-phényloxazolidinone et l'hormone stimulant la thyroïde. Cette étude a analysé la composition des conditions optimales d'hydrolyse enzymatique pour le BRIe en utilisant la GC-MS, et a identifié sept produits liés à l'hydrolyse enzymatique, à savoir la 3-amino-2-oxazolidinone, la 2-oxazolidinethione, le 3-buten-1-ylisothiocyanate (BITC), le phényl-isothiocyanate (PEITC), l'ester propylique du 1-isothiocyanate, l'ester isopropylique de l'isothiocyanate et le 2-phénylisothiocyanate (2-PITC), dont 4 étaient des types d'isothiocyanate.

De nombreuses études ont montré que les isothiocyanates peuvent prévenir l'apparition de divers cancers. La recherche a révélé que le PEITC inhibe de manière dépendante de la dose la prolifération de la lignée cellulaire d'ostéosarcome de souris K7M2 et peut provoquer l'arrêt du cycle cellulaire G2/M et l'apoptose ; le BITC peut réduire de manière significative la viabilité cellulaire de la cellule d'adénocarcinome gastrique AGS et induire l'apoptose et l'autophagie. Cependant, il existe actuellement peu de rapports sur les effets et les mécanismes des isothiocyanates sur le cancer du col de l'utérus. Cette étude a montré, à l'aide d'un modèle cellulaire in vitro, que le BRIe inhibait de manière significative la prolifération des cellules cancéreuses du col de l'utérus Hela, Siha et U14, en fonction du temps et de la dose. En comparant les valeurs IC50 sur 24 heures de ces trois types de cellules, on conclut que les cellules Hela sont les plus sensibles à BRIe. La prolifération cellulaire incontrôlée est la cause fondamentale du cancer, qui est due à la perturbation du cycle cellulaire. L'analyse par cytométrie en flux a révélé que BRIe peut arrêter le cycle cellulaire de Hela dans les phases S et G2/M. La métastase des cellules cancéreuses a toujours été un point névralgique de la recherche et un défi pour le traitement clinique. Des expériences de grattage ont montré que BRIe peut inhiber efficacement la migration des cellules Hela. La coloration Hochest 33258 a révélé que BRIe peut induire une condensation de l'ADN dans les noyaux des cellules Hela, et une fluorescence granulaire visible peut être observée dans les noyaux, ce qui suggère qu'il s'agit d'un corps apoptotique. Une analyse plus poussée utilisant la double coloration Annexin V-FITC a révélé que le taux d'apoptose des cellules Hela traitées avec BRIe augmentait avec la concentration après 24 heures, ce qui indique que BRIe induit l'apoptose dans les cellules Hela. En résumé, l'IRBe présente une activité anti-cancer du col de l'utérus significative. Sur la base des données GC-MS, on suppose que le BITC, le PEITC, l'isothiocyanate d'isopropyle et le 2-PITC pourraient être ses principaux ingrédients actifs, qui doivent être validés par des expériences in vitro et in vivo.

En résumé, cette étude a déterminé pour la première fois le processus de préparation optimal pour l'hydrolyse enzymatique exogène des isothiocyanates dans le Chamagu. Sept produits liés à l'hydrolyse enzymatique ont été identifiés par analyse GC-MS, et le produit d'hydrolyse enzymatique BRIe obtenu a la capacité d'inhiber la prolifération des cellules cancéreuses du col de l'utérus, de supprimer la migration cellulaire, d'induire l'arrêt du cycle cellulaire et l'apoptose. Cette recherche fournit une base de référence pour le développement et l'utilisation des ressources végétales de Chamagu. Les résultats de la recherche ont été publiés dans le 6e numéro de Natural Product Research and Development en 2024.