Preparación enzimática y actividad anticancerígena del isotiocianato de chamagu

En los últimos años, la tasa de incidencia del cáncer está aumentando rápidamente en China, y la prevención y el tratamiento del cáncer son urgentes. Las investigaciones demuestran que el aumento de la ingesta de verduras crucíferas puede reducir eficazmente la tasa de incidencia del cáncer. Las verduras del género Brassicaceae contienen abundantes glucosinolatos, también conocidos como glucosinolatos (GL). Cuando las plantas sufren daños mecánicos, los GL pueden ser hidrolizados por su propia mirosinasa para producir isotiocianatos. Los isotiocianatos son una clase de compuestos que contienen dobles enlaces conjugados, con una fórmula molecular de R-N=C=S (R representa diferentes tipos de grupos alquilo). En los últimos años, los isotiocianatos se han convertido en un foco de investigación por su extraordinaria actividad biológica. La investigación ha demostrado que los isotiocianatos tienen diversas actividades biológicas, como antitumorales, antibacterianas, eliminación de radicales libres y resistencia a patógenos. Se han desarrollado y utilizado en muchos campos, como la sanidad, la alimentación y la agricultura.

Brassica rapa L., nombre científico "nabo", es una planta herbácea bienal perteneciente a la familia Brassicaceae. Se distribuye principalmente en el suroeste de las montañas Tianshan y el noroeste de Tarim, en Xinjiang, y es una especialidad vegetal local consumida habitualmente por personas de todos los grupos étnicos de Xinjiang. Las investigaciones han descubierto que las raíces de chamagu contienen abundantes GL. Zhuang et al. utilizaron la tecnología de cromatografía líquida ultra alta para analizar los tipos y contenidos de GL en diferentes etapas de desarrollo y partes del crecimiento (raíces, tallos, hojas) de los nabos de Xinjiang durante su periodo de crecimiento nutricional. Encontraron que había ciertas diferencias en los tipos y fracciones de masa de glucosinolatos durante las diferentes etapas de desarrollo del crecimiento nutricional. Las diferencias en los tipos y contenidos de GLs en las plantas conducirán a variaciones en los tipos y contenidos de isotiocianatos, dando lugar a diferentes actividades biológicas. Sun ha informado de que las semillas de Qiamagu contienen cuatro tipos de isotiocianatos: isotiocianato de fenetilo, isotiocianato de terc-butilo, isotiocianato de isopropilo e isotiocianato de alilo.

En la actualidad, la preparación de isotiocianatos implica principalmente la síntesis química y la hidrólisis enzimática. Entre ellos, el método de síntesis química tiene pasos complicados, muchos productos intermedios, no es respetuoso con el medio ambiente, y tiene una baja tasa de síntesis; la hidrólisis enzimática utiliza el sistema de glucosinolato mirosinasa en plantas crucíferas para extraer isotiocianatos, que tiene las ventajas de un funcionamiento sencillo y un rendimiento relativamente alto. La hidrólisis enzimática se divide en método de degradación por mirosinasa endógena y método de degradación por mirosinasa exógena. Usando la hidrólisis enzimática endógena para preparar isotiocianatos, aunque el proceso es simple, la mirosinasa endógena en las plantas no puede liberarse completamente, lo que resulta en un largo tiempo de hidrólisis enzimática y baja eficiencia. Ding comparó la cantidad de isotiocianatos generados por la degradación de GLs por enzimas endógenas y exógenas en colza y descubrió que la cantidad de isotiocianatos generados por la mirosinasa exógena era 7,6 veces superior a la de la mirosinasa endógena. La identificación y el análisis GC-MS mostraron que la mirosinasa exógena tenía una variedad de productos de degradación, un contenido relativamente alto y menos impurezas.

En este estudio se utilizó la raíz de chamagu como materia prima y se empleó el método de degradación por mirosinasa exógena para preparar isotiocianato de chamagu (BRICe). Sobre la base del cribado de un solo factor, el tiempo de hidrólisis enzimática, la temperatura, el pH y la concentración de ácido ascórbico se identificaron como factores influyentes significativos. Se utilizó un experimento ortogonal de cuatro factores y tres niveles para optimizar el proceso de extracción. Por último, se analizó su composición química mediante cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS) y se estudió el efecto anticancerígeno del isotiocianato.

El cáncer es una de las enfermedades malignas que amenazan la seguridad de la vida humana. Múltiples estudios epidemiológicos han descubierto que consumir más verduras crucíferas puede reducir eficazmente el riesgo de cáncer. El isotiocianato es uno de los productos de la hidrólisis enzimática propia de las verduras crucíferas. Las investigaciones han demostrado que los isotiocianatos pueden activar las enzimas de fase II en el cuerpo humano, permitiendo que los productos de las reacciones de fase I se unan con el ácido glucurónico y el glutatión, favoreciendo así la rápida eliminación de los carcinógenos del organismo. Por lo tanto, los isotiocianatos pueden utilizarse como inhibidores del cáncer en medicina. Qiamagu es una planta medicinal y comestible de Xinjiang, que contiene varios ingredientes activos como glucosinolatos, flavonoides, isotiocianatos y polisacáridos. Sin embargo, el desarrollo y la utilización de los isotiocianatos de Qiamagu son actualmente insuficientes. La hidrólisis enzimática es actualmente un método respetuoso con el medio ambiente para extraer isotiocianatos. Mediante la optimización de las condiciones de hidrólisis enzimática, no sólo se puede reducir la producción de otros metabolitos secundarios, sino que también se puede acelerar la tasa de producción del producto objetivo, aumentando así el rendimiento. Jang preparó isotiocianatos utilizando mirosinasa endógena en la familia Brassicaceae. Aunque el método de la enzima endógena tiene un proceso sencillo, la mirosinasa de las plantas no puede liberarse por completo, lo que resulta en un largo tiempo de hidrólisis enzimática y una baja eficiencia. En comparación con las enzimas endógenas, el uso de enzimas exógenas para preparar isotiocianatos es más fácil de controlar las condiciones de hidrólisis enzimática de las enzimas exógenas, lo que es beneficioso para dirigir los cambios en los tipos de productos de hidrólisis enzimática y aumentar la cantidad de productos. Por lo tanto, optimizar las condiciones de hidrólisis enzimática externa es la clave para preparar isotiocianatos.

La formación de productos de hidrólisis enzimática no sólo está relacionada con el tipo de glucosinolato, sino que también incluye el tiempo de hidrólisis, la temperatura de hidrólisis, el pH, la presión y la presencia de Fe2+. Latt é encontró que cuando el pH de la solución es neutro, es favorable para los glucosinolatos formar isotiocianatos. Sin embargo, cuando el pH es ácido/alcalino, o cuando están presentes proteínas cíclicas características del azufre o Fe2+, los productos de la hidrólisis enzimática formarán una gran cantidad de nitrilos. Yang utilizó la metodología de superficie de respuesta para analizar los factores de pH, EDTA, y ácido ascórbico, y encontró que estos tres factores tienen un impacto significativo en la cantidad de extracción de isotiocianato. Burmeister encontró que el ácido ascórbico reemplazó la función de base catalítica en el sitio activo de la mirosinasa, exhibiendo propiedades catalíticas de la mirosinasa. La adición de una cantidad adecuada de ácido ascórbico al brócoli fresco puede mejorar significativamente la actividad de la mirosinasa, aumentando así la producción de isotiocianatos. En este estudio se utilizó el método de degradación de la mirosinasa exógena (derivada de las semillas de mostaza blanca) para preparar BRIe. Las condiciones de hidrólisis enzimática se optimizaron mediante experimentos de factor único y ortogonales, y se seleccionaron cuatro factores que tenían un impacto significativo en la extracción de BRIe: tiempo de hidrólisis enzimática, temperatura de hidrólisis enzimática, concentración de ácido ascórbico y pH. Las condiciones óptimas de hidrólisis enzimática para BRIe se determinaron de la siguiente manera: la adición de mirosinasa de 20 μ L, la temperatura de reacción de 70 ℃, el tiempo de reacción de 3h, pH de 6,5, la concentración de ácido ascórbico de 0,1 mg / g, y GLs polvo liofilizado de 2g. Es interesante que la temperatura óptima de hidrólisis enzimática para este estudio es de 70 ℃. Hay informes de investigación que el rango de temperatura para la hidrólisis enzimática de isotiocianatos vegetales de brócoli es de 20-60 ℃, siendo la temperatura óptima de hidrólisis enzimática de 40 ℃; El rango de temperatura para la extracción de isotiocianatos de raíces de wasabi es de 30-90 ℃, y la temperatura óptima de hidrólisis enzimática es de 70 ℃. Por lo tanto, la temperatura óptima para la mirosinasa varía en función de la especie de origen.

Normalmente, los tipos de isotiocianatos formados varían en función de las condiciones de la hidrólisis enzimática. Chen et al. utilizaron la hidrólisis enzimática endógena para identificar los productos de la hidrólisis enzimática en el brócoli como isotiocianato de alilo, isotiocianato de isobutilo, isotiocianato de 1-butenilo, 4-metiltiopentonitrilo 5-metiltiopentonitrilo, 3-(metiltio) propil isotiocianato, butil isotiocianato, tiocianato de rábano y sulforafano de rábano mediante GC-MS, siendo el sulforafano de rábano el de mayor contenido. Yang utilizó la hidrólisis enzimática exógena para identificar los productos de la hidrólisis enzimática en el brócoli como isotiocianato de alilo, isotiocianato de fenetilo, isotiocianato de ciclopentilo, fenilpropanonitrilo, 2,1-feniloxazolidinona y hormona estimulante de la tiroides. En este estudio se analizó la composición de las condiciones óptimas de hidrólisis enzimática de la BRIe mediante GC-MS, y se identificaron siete productos relacionados con la hidrólisis enzimática, a saber, 3-amino-2-oxazolidinona, 2-oxazolidinethione, 3-buten-1-ilisotiocianato (BITC), isotiocianato de fenilo (PEITC), éster propílico de 1-isotiocianato, éster isopropílico de isotiocianato y 2-fenilisotiocianato (2-PITC), de los cuales 4 eran de tipo isotiocianato.

Muchos estudios han demostrado que los isotiocianatos pueden prevenir la aparición de diversos tipos de cáncer. Las investigaciones han descubierto que el PEITC inhibe de forma dependiente de la dosis la proliferación de la línea celular de osteosarcoma de ratón K7M2 y puede provocar la detención del ciclo celular G2/M y la apoptosis; el BITC puede reducir significativamente la viabilidad celular de la célula de adenocarcinoma gástrico AGS e inducir la apoptosis y la autofagia. Sin embargo, en la actualidad existen pocos informes sobre los efectos y mecanismos de los isotiocianatos en el cáncer de cuello uterino. En este estudio se descubrió, mediante un modelo celular in vitro, que la BRIe inhibía significativamente la proliferación de las células de cáncer de cuello de útero Hela, Siha y U14 en función del tiempo y de la dosis. Comparando los valores IC50 en 24 horas de estos tres tipos de células, se concluye que las células Hela son las más sensibles al BRIe. La proliferación celular descontrolada es la causa fundamental del cáncer, que se debe a la alteración del ciclo celular. El análisis por citometría de flujo reveló que la BRIe puede detener el ciclo celular de las células Hela en las fases S y G2/M. La metástasis de las células cancerosas siempre ha sido un punto caliente de la investigación y un reto para el tratamiento clínico. Mediante experimentos de rascado, se descubrió que BRIe puede inhibir eficazmente la migración de células Hela. La tinción con Hochest 33258 reveló que la BRIe puede inducir la condensación del ADN en los núcleos de las células Hela, y se puede observar una fluorescencia granular visible en los núcleos, lo que sugiere que se trata de un cuerpo apoptótico. Un análisis más detallado utilizando la tinción doble Annexin V-FITC reveló que la tasa de apoptosis de las células Hela tratadas con BRIe aumentaba con el incremento de la concentración después de 24 horas, lo que indica que BRIe inducía la apoptosis en las células Hela. En resumen, la BRIe muestra una actividad significativa contra el cáncer de cuello de útero. A partir de los datos de GC-MS, se especula que el BITC, el PEITC, el isotiocianato de isopropilo y el 2-PITC pueden ser sus principales ingredientes activos, que deben ser validados mediante experimentos in vitro e in vivo.

En resumen, este estudio ha determinado por primera vez el proceso de preparación óptimo para la hidrólisis enzimática exógena de isotiocianatos en Chamagu. Se identificaron siete productos relacionados con la hidrólisis enzimática mediante análisis GC-MS, y el producto de hidrólisis enzimática BRIe obtenido tiene la capacidad de inhibir la proliferación de células de cáncer cervical, suprimir la migración celular, inducir la detención del ciclo celular y la apoptosis. La investigación proporciona una base de referencia para un mayor desarrollo y utilización de los recursos vegetales de Chamagu. Los resultados de la investigación se publicaron en el 6º número de Natural Product Research and Development de 2024.