Enzymatische Herstellung und Aktivität von Chamagu-Isothiocyanat gegen Gebärmutterhalskrebs
In den letzten Jahren ist die Zahl der Krebserkrankungen in China stark angestiegen, und die Vorbeugung und Behandlung von Krebs ist dringend erforderlich. Die Forschung zeigt, dass ein erhöhter Verzehr von Kreuzblütlern die Krebsinzidenz wirksam senken kann. Brassicaceae-Gemüse enthält reichlich Glucosinolate, auch bekannt als Glucosinolate (GLs). Wenn Pflanzen mechanisch beschädigt werden, können die GL durch ihre eigene Myrosinase hydrolysiert werden, um Isothiocyanate zu bilden. Isothiocyanate sind eine Klasse von Verbindungen mit konjugierten Doppelbindungen und der Molekularformel R-N=C=S (R steht für verschiedene Arten von Alkylgruppen). In den letzten Jahren haben sich Isothiocyanate aufgrund ihrer herausragenden biologischen Aktivität zu einem Forschungsschwerpunkt entwickelt. Die Forschung hat gezeigt, dass Isothiocyanate verschiedene biologische Aktivitäten haben, wie z.B. Anti-Tumor, antibakteriell, freie Radikale fangend und resistent gegen Pathogene. Isothiocyanate wurden entwickelt und in vielen Bereichen wie Gesundheit, Lebensmittel und Landwirtschaft eingesetzt.
Brassica rapa L., wissenschaftlicher Name "Rübe", ist eine zweijährige krautige Pflanze, die zur Familie der Brassicaceae gehört. Sie ist hauptsächlich im Südwesten des Tianshan-Gebirges und im Nordwesten des Tarim-Gebirges in Xinjiang verbreitet und ist eine lokale Gemüsespezialität, die von Menschen aller ethnischen Gruppen in Xinjiang verzehrt wird. Untersuchungen haben ergeben, dass Chamagu-Wurzeln reichlich GL enthalten. Zhuang et al. analysierten mit Hilfe der Ultrahochgeschwindigkeitschromatographie die Arten und Gehalte von GL in verschiedenen Entwicklungsstadien und Wachstumsteilen (Wurzeln, Stängel, Blätter) von Xinjiang-Rüben während ihrer Ernährungsphase. Sie stellten fest, dass es gewisse Unterschiede in den Arten und Massenanteilen von Glucosinolaten während der verschiedenen Entwicklungsstadien des Ernährungswachstums gab. Die Unterschiede in den Arten und Gehalten von GLs in Pflanzen führen zu Variationen in den Arten und Gehalten von Isothiocyanaten, was zu unterschiedlichen biologischen Aktivitäten führt. Sun hat berichtet, dass Qiamagu-Samen vier Arten von Isothiocyanaten enthalten: Phenethylisothiocyanat, tert-Butylisothiocyanat, Isopropylisothiocyanat und Allylisothiocyanat.
Zurzeit werden Isothiocyanate hauptsächlich durch chemische Synthese und enzymatische Hydrolyse hergestellt. Die chemische Synthesemethode hat komplizierte Schritte, viele Zwischenprodukte, ist nicht umweltfreundlich und hat eine niedrige Syntheserate. Die enzymatische Hydrolyse nutzt das Glucosinolat-Myrosinase-System in Kreuzblütlern, um Isothiocyanate zu extrahieren, was den Vorteil hat, dass es einfach zu handhaben und relativ ergiebig ist. Bei der enzymatischen Hydrolyse unterscheidet man zwischen dem endogenen Myrosinase-Abbau und dem exogenen Myrosinase-Abbau. Bei der Verwendung der endogenen enzymatischen Hydrolyse zur Herstellung von Isothiocyanaten ist das Verfahren zwar einfach, aber die endogene Myrosinase in den Pflanzen kann nicht vollständig freigesetzt werden, was zu einer langen enzymatischen Hydrolysezeit und geringer Effizienz führt. Ding verglich die Menge an Isothiocyanaten, die durch den Abbau von GL durch endogene und exogene Enzyme in Raps entstehen, und stellte fest, dass die Menge an Isothiocyanaten, die durch exogene Myrosinase erzeugt wurde, 7,6 Mal so hoch war wie die der endogenen Myrosinase. Die GC-MS-Identifizierung und -Analyse zeigte, dass die exogene Myrosinase eine Vielzahl von Abbauprodukten, einen relativ hohen Gehalt und weniger Verunreinigungen aufwies.
In dieser Studie wurde die Chamagu-Wurzel als Rohmaterial verwendet und die Methode des exogenen Myrosinase-Abbaus zur Herstellung von Chamagu-Isothiocyanat (BRICe) eingesetzt. Auf der Grundlage eines Einzelfaktor-Screenings wurden die Enzym-Hydrolysezeit, die Temperatur, der pH-Wert und die Ascorbinsäurekonzentration als wichtige Einflussfaktoren identifiziert. Zur Optimierung des Extraktionsprozesses wurde ein dreistufiges orthogonales Experiment mit vier Faktoren durchgeführt. Schließlich wurde die chemische Zusammensetzung durch Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS) analysiert und die krebshemmende Wirkung von Isothiocyanat untersucht.
Krebs ist eine der bösartigen Krankheiten, die die Sicherheit des menschlichen Lebens bedrohen. Mehrere epidemiologische Studien haben ergeben, dass der Verzehr von mehr Kreuzblütlern das Krebsrisiko wirksam senken kann. Isothiocyanat ist eines der Produkte der enzymatischen Selbsthydrolyse in Kreuzblütlern. Die Forschung hat gezeigt, dass Isothiocyanate die Phase-II-Enzyme im menschlichen Körper aktivieren können, so dass sich die Produkte der Phase-I-Reaktionen mit Glucuronsäure und Glutathion verbinden können, was die schnelle Ausscheidung von Karzinogenen aus dem Körper fördert. Daher können Isothiocyanate in der Medizin als Krebshemmer eingesetzt werden. Qiamagu ist eine medizinische und essbare Pflanze in Xinjiang, die verschiedene Wirkstoffe wie Glucosinolate, Flavonoide, Isothiocyanate und Polysaccharide enthält. Die Entwicklung und Nutzung von Qiamagu-Isothiocyanaten ist jedoch derzeit unzureichend. Die enzymatische Hydrolyse ist derzeit eine umweltfreundliche Methode zur Gewinnung von Isothiocyanaten. Durch die Optimierung der Bedingungen für die enzymatische Hydrolyse kann nicht nur die Produktion anderer Sekundärmetaboliten verringert, sondern auch die Produktionsrate des Zielprodukts beschleunigt und damit die Ausbeute erhöht werden. Jang stellte Isothiocyanate mit Hilfe endogener Myrosinase in der Familie der Brassicaceae her. Obwohl die Methode mit endogenen Enzymen ein einfaches Verfahren ist, kann die Myrosinase in Pflanzen nicht vollständig freigesetzt werden, was zu einer langen enzymatischen Hydrolysezeit und einer geringen Effizienz führt. Im Vergleich zu endogenen Enzymen ist es bei der Verwendung exogener Enzyme zur Herstellung von Isothiocyanaten einfacher, die Bedingungen für die enzymatische Hydrolyse zu kontrollieren, was sich positiv auf die Steuerung von Veränderungen in den Arten der enzymatischen Hydrolyseprodukte und die Erhöhung der Produktmenge auswirkt. Daher ist die Optimierung der externen enzymatischen Hydrolysebedingungen der Schlüssel zur Herstellung von Isothiocyanaten.
Die Bildung von enzymatischen Hydrolyseprodukten hängt nicht nur von der Art des Glucosinolats ab, sondern auch von der Hydrolysezeit, der Hydrolysetemperatur, dem pH-Wert, dem Druck und der Anwesenheit von Fe2+. Latt é fand heraus, dass bei einem neutralen pH-Wert der Lösung die Bildung von Isothiocyanaten durch Glucosinolate begünstigt wird. Ist der pH-Wert jedoch sauer/alkalisch oder sind für zyklischen Schwefel charakteristische Proteine oder Fe2+ vorhanden, bilden die enzymatischen Hydrolyseprodukte eine große Menge an Nitrilen. Yang analysierte die Faktoren pH-Wert, EDTA und Ascorbinsäure mit Hilfe der Response-Surface-Methode und stellte fest, dass diese drei Faktoren einen erheblichen Einfluss auf die Extraktionsmenge von Isothiocyanat haben. Burmeister fand heraus, dass Ascorbinsäure die Funktion der katalytischen Base im aktiven Zentrum der Myrosinase ersetzt und somit katalytische Eigenschaften der Myrosinase aufweist. Die Zugabe einer angemessenen Menge an Ascorbinsäure zu frischem Brokkoli kann die Aktivität der Myrosinase erheblich steigern und dadurch die Produktion von Isothiocyanaten erhöhen. In dieser Studie wurde zur Herstellung von BRIe die Methode des Abbaus exogener Myrosinase (aus weißen Senfsamen) verwendet. Die Bedingungen für die enzymatische Hydrolyse wurden mit Hilfe von Einzelfaktor- und orthogonalen Experimenten optimiert, und es wurden vier Faktoren untersucht, die einen signifikanten Einfluss auf die Extraktion von BRIe hatten: Enzymatische Hydrolysezeit, enzymatische Hydrolysetemperatur, Ascorbinsäurekonzentration und pH-Wert. Die optimalen Bedingungen für die enzymatische Hydrolyse von BRIe wurden wie folgt bestimmt: Zugabe von 20 μ L Myrosinase, Reaktionstemperatur von 70 ℃, Reaktionszeit von 3h, pH-Wert von 6,5, Ascorbinsäurekonzentration von 0,1mg/g und gefriergetrocknetes GL-Pulver von 2g. Interessant ist, dass die optimale enzymatische Hydrolysetemperatur für diese Studie 70 ℃ beträgt. Es gibt Forschungsberichte, wonach der Temperaturbereich für die enzymatische Hydrolyse von pflanzlichen Isothiocyanaten aus Brokkoli 20-60 ℃ beträgt, wobei die optimale enzymatische Hydrolysetemperatur bei 40 ℃ liegt; der Temperaturbereich für die Extraktion von Isothiocyanaten aus Wasabi-Wurzeln liegt bei 30-90 ℃, und die optimale enzymatische Hydrolysetemperatur beträgt 70 ℃. Daher variiert die optimale Temperatur für Myrosinase in Abhängigkeit von der Herkunftsart.
Normalerweise variieren die Arten der gebildeten Isothiocyanate je nach den Bedingungen der enzymatischen Hydrolyse. Chen et al. verwendeten die endogene enzymatische Hydrolyse, um die enzymatischen Hydrolyseprodukte in Brokkoli als Allylisothiocyanat, Isobutylisothiocyanat, 1-Butenylisothiocyanat, 4-Methylthionitril, 5-Methylthiopentonitril, 3-(Methylthio)propylisothiocyanat, Butylisothiocyanat, Rettichthiocyanat und Rettichsulforaphan mittels GC-MS, wobei Rettichsulforaphan den höchsten Gehalt aufwies. Yang verwendete exogene enzymatische Hydrolyse, um die enzymatischen Hydrolyseprodukte in Brokkoli als Allylisothiocyanat, Phenethylisothiocyanat, Cyclopentylisothiocyanat, Phenylpropanonitril, 2,1-Phenyloxazolidinon und schilddrüsenstimulierendes Hormon zu identifizieren. In dieser Studie wurde die Zusammensetzung der optimalen enzymatischen Hydrolysebedingungen für BRIe mithilfe von GC-MS analysiert, und es wurden sieben mit der enzymatischen Hydrolyse verbundene Produkte identifiziert, nämlich 3-Amino-2-oxazolidinon, 2-Oxazolidinethion, 3-Buten-1-ylisothiocyanat (BITC), Phenylisothiocyanat (PEITC), 1-Isothiocyanat-Propylester, Isothiocyanat-Isopropylester und 2-Phenylisothiocyanat (2-PITC), von denen vier Isothiocyanat-Typen waren.
Viele Studien haben gezeigt, dass Isothiocyanate das Auftreten von verschiedenen Krebsarten verhindern können. Die Forschung hat ergeben, dass PEITC dosisabhängig die Vermehrung der Osteosarkom-Zelllinie K7M2 der Maus hemmt und eine Verlangsamung des G2/M-Zellzyklus sowie Apoptose bewirken kann; BITC kann die Lebensfähigkeit von Magen-Adenokarzinomzellen (AGS) erheblich verringern und Apoptose und Autophagie auslösen. Allerdings gibt es derzeit nur wenige Berichte über die Wirkungen und Mechanismen von Isothiocyanaten bei Gebärmutterhalskrebs. In dieser Studie wurde anhand eines In-vitro-Zellmodells festgestellt, dass BRIe die Proliferation der Gebärmutterhalskrebszellen Hela, Siha und U14 in einer zeit- und dosisabhängigen Weise deutlich hemmt. Vergleicht man die 24-Stunden-IC50-Werte dieser drei Zelltypen, so kommt man zu dem Schluss, dass die Hela-Zellen am empfindlichsten auf BRIe reagieren. Unkontrollierte Zellproliferation ist die grundlegende Ursache von Krebs, die auf eine Störung des Zellzyklus zurückzuführen ist. Die Analyse der Durchflusszytometrie ergab, dass BRIe den Zellzyklus von Hela in den Phasen S und G2/M anhalten kann. Die Metastasierung von Krebszellen war schon immer ein Forschungsschwerpunkt und eine Herausforderung für die klinische Behandlung. Durch Scratch-Experimente wurde festgestellt, dass BRIe die Migration von Hela-Zellen wirksam hemmen kann. Die Färbung mit Hochest 33258 zeigte, dass BRIe eine DNA-Kondensation in den Zellkernen von Hela-Zellen hervorrufen kann, und in den Zellkernen ist eine sichtbare körnige Fluoreszenz zu beobachten, was darauf hindeutet, dass es sich um einen apoptotischen Körper handelt. Eine weitere Analyse mit Annexin V-FITC-Doppelfärbung ergab, dass die Apoptoserate von Hela-Zellen, die mit BRIe behandelt wurden, mit steigender Konzentration nach 24 Stunden zunahm, was darauf hindeutet, dass BRIe die Apoptose in Hela-Zellen auslöst. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass BRIe eine signifikante Anti-Gebärmutterhalskrebs-Aktivität aufweist. Auf der Grundlage von GC-MS-Daten wird spekuliert, dass BITC, PEITC, Isopropylisothiocyanat und 2-PITC seine Hauptwirkstoffe sein könnten, die durch In-vitro- und In-vivo-Versuche weiter validiert werden müssen.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass in dieser Studie zum ersten Mal das optimale Herstellungsverfahren für die exogene enzymatische Hydrolyse von Isothiocyanaten in Chamagu bestimmt wurde. Sieben mit der enzymatischen Hydrolyse verbundene Produkte wurden durch GC-MS-Analyse identifiziert, und das erhaltene enzymatische Hydrolyseprodukt BRIe hat die Fähigkeit, die Proliferation von Gebärmutterhalskrebszellen zu hemmen, die Zellmigration zu unterdrücken, einen Zellzyklusstillstand und Apoptose zu induzieren. Die Forschung liefert eine Referenzgrundlage für die weitere Entwicklung und Nutzung der Chamagu-Pflanzenressourcen. Die Forschungsergebnisse wurden in der 6. Ausgabe von Natural Product Research and Development im Jahr 2024 veröffentlicht.