Enzymatisk fremstilling og aktivitet mod livmoderhalskræft af Chamagu-isothiocyanat

I de senere år er forekomsten af kræft steget hurtigt i Kina, og det haster med at forebygge og behandle kræft. Forskning viser, at øget indtag af korsblomstrede grøntsager effektivt kan reducere forekomsten af kræft. Brassicaceae-grøntsager indeholder masser af glucosinolater, også kendt som glucosinolater (GL'er). Når planter beskadiges mekanisk, kan GL'er hydrolyseres af deres egen myrosinase for at producere isothiocyanater. Isothiocyanater er en klasse af forbindelser, der indeholder konjugerede dobbeltbindinger med molekylformlen R-N=C=S (R repræsenterer forskellige typer af alkylgrupper). I de senere år er isothiocyanater blevet et hotspot inden for forskningen på grund af deres enestående biologiske aktivitet. Forskning har vist, at isothiocyanater har forskellige biologiske aktiviteter såsom antitumor, antibakteriel, fjernelse af frie radikaler og patogenresistens. De er blevet udviklet og brugt inden for mange områder som sundhedspleje, fødevarer og landbrug.

Brassica rapa L., det videnskabelige navn "majroe", er en toårig urteagtig plante, der tilhører Brassicaceae-familien. Den er hovedsageligt udbredt i den sydvestlige del af Tianshan-bjergene og den nordvestlige del af Tarim i Xinjiang og er en lokal specialgrøntsag, der ofte spises af folk fra alle etniske grupper i Xinjiang. Forskning har vist, at Chamagu-rødder indeholder masser af GL'er. Zhuang et al. brugte ultra-high liquid chromatography-teknologi til at analysere typer og indhold af GL'er i forskellige udviklingsstadier og vækstdele (rødder, stængler, blade) af Xinjiang-roe i løbet af deres ernæringsmæssige vækstperiode. De fandt ud af, at der var visse forskelle i typerne og massefraktionerne af glukosinolater i de forskellige udviklingsstadier af den ernæringsmæssige vækst. Forskellene i typer og indhold af GL'er i planter vil føre til variationer i typer og indhold af isothiocyanater, hvilket resulterer i forskellige biologiske aktiviteter. Sun har rapporteret, at Qiamagu-frø indeholder fire typer isothiocyanater: phenethylisothiocyanat, tert butylisothiocyanat, isopropylisothiocyanat og allylisothiocyanat.

På nuværende tidspunkt involverer fremstillingen af isothiocyanater hovedsageligt kemisk syntese og enzymatisk hydrolyse. Blandt dem har den kemiske syntesemetode komplicerede trin, mange mellemprodukter, er ikke miljøvenlig og har en lav syntesehastighed; Enzymatisk hydrolyse bruger glucosinolat-myrosinasesystemet i korsblomstrede planter til at udvinde isothiocyanater, hvilket har fordelene ved enkel betjening og relativt højt udbytte. Enzymatisk hydrolyse er opdelt i endogen myrosinase-nedbrydningsmetode og eksogen myrosinase-nedbrydningsmetode. Ved hjælp af endogen enzymatisk hydrolyse til fremstilling af isothiocyanater, selvom processen er enkel, kan den endogene myrosinase i planter ikke frigives fuldt ud, hvilket resulterer i lang enzymatisk hydrolysetid og lav effektivitet. Ding sammenlignede mængden af isothiocyanater genereret ved GL-nedbrydning af endogene og eksogene enzymer i rapsfrø og fandt, at mængden af isothiocyanater genereret af eksogen myrosinase var 7,6 gange så stor som den endogene myrosinase. GC-MS-identifikation og -analyse viste, at eksogen myrosinase havde en række forskellige nedbrydningsprodukter, et relativt højt indhold og færre urenheder.

Denne undersøgelse brugte Chamagu-rod som råmateriale og anvendte eksogen myrosinase-nedbrydningsmetode til at fremstille Chamagu-isothiocyanat (BRICe). På baggrund af enkeltfaktorscreening blev enzymhydrolysetid, temperatur, pH og ascorbinsyrekoncentration identificeret som væsentlige påvirkningsfaktorer. Et ortogonalt eksperiment med fire faktorer på tre niveauer blev brugt til at optimere ekstraktionsprocessen. Endelig blev den kemiske sammensætning analyseret ved hjælp af gaskromatografi-massespektrometri (GC-MS), og isothiocyanatets anticancereffekt blev undersøgt.

Kræft er en af de ondartede sygdomme, der truer menneskers liv. Flere epidemiologiske undersøgelser har vist, at indtagelse af flere korsblomstrede grøntsager effektivt kan reducere risikoen for kræft. Isothiocyanat er et af produkterne af selv-enzymatisk hydrolyse i korsblomstrede grøntsager. Forskning har vist, at isothiocyanater kan aktivere fase II-enzymer i menneskekroppen, så produkterne fra fase I-reaktionerne kan binde sig til glucuronsyre og glutathion og dermed fremme en hurtig udskillelse af kræftfremkaldende stoffer fra kroppen. Derfor kan isothiocyanater bruges som kræfthæmmer i medicin. Qiamagu er en medicinsk og spiselig plante i Xinjiang, der indeholder forskellige aktive ingredienser som glucosinolater, flavonoider, isothiocyanater og polysaccharider. Men udviklingen og udnyttelsen af Qiamagu-isothiocyanater er i øjeblikket utilstrækkelig. Enzymatisk hydrolyse er i øjeblikket en miljøvenlig metode til udvinding af isothiocyanater. Ved at optimere betingelserne for enzymatisk hydrolyse kan man ikke kun reducere produktionen af andre sekundære metabolitter, men også fremskynde produktionen af målproduktet og dermed øge udbyttet. Jang fremstillede isothiocyanater ved hjælp af endogen myrosinase i Brassicaceae-familien. Selv om den endogene enzymmetode har en enkel proces, kan myrosinasen i planter ikke frigives fuldt ud, hvilket resulterer i lang enzymatisk hydrolysetid og lav effektivitet. Sammenlignet med endogene enzymer er det lettere at kontrollere de enzymatiske hydrolysebetingelser for eksogene enzymer ved at bruge eksogene enzymer til at fremstille isothiocyanater, hvilket er gavnligt for at styre ændringer i typerne af enzymatiske hydrolyseprodukter og øge mængden af produkter. Derfor er optimering af de eksterne enzymatiske hydrolysebetingelser nøglen til fremstilling af isothiocyanater.

Dannelsen af enzymatiske hydrolyseprodukter er ikke kun relateret til typen af glucosinolat, men omfatter også hydrolysetid, hydrolysetemperatur, pH, tryk og tilstedeværelsen af Fe2+. Latt é fandt ud af, at når opløsningens pH er neutral, er det gunstigt for glucosinolater at danne isothiocyanater. Men når pH-værdien er sur/alkalisk, eller når cykliske svovlkarakteristiske proteiner eller Fe2+ er til stede, vil de enzymatiske hydrolyseprodukter danne en stor mængde nitriler. Yang brugte responsoverflademetoden til at analysere faktorerne pH, EDTA og ascorbinsyre og fandt ud af, at disse tre faktorer har en betydelig indvirkning på ekstraktionsmængden af isothiocyanat. Burmeister fandt ud af, at ascorbinsyre erstattede den katalytiske basefunktion i myrosinases aktive område og udviste myrosinases katalytiske egenskaber. Tilsætning af en passende mængde ascorbinsyre til frisk broccoli kan øge aktiviteten af myrosinase betydeligt og dermed øge produktionen af isothiocyanater. I denne undersøgelse blev der brugt eksogen myrosinase (fra hvide sennepsfrø) som nedbrydningsmetode til at fremstille BRIe. De enzymatiske hydrolysebetingelser blev optimeret gennem enkeltfaktor- og ortogonale eksperimenter, og fire faktorer, der havde en betydelig indvirkning på ekstraktionen af BRIe, blev screenet: enzymatisk hydrolysetid, enzymatisk hydrolysetemperatur, ascorbinsyrekoncentration og pH. De optimale enzymatiske hydrolysebetingelser for BRIe blev bestemt som følger: tilsætning af myrosinase på 20 μL, reaktionstemperatur på 70 °C, reaktionstid på 3 timer, pH på 6,5, ascorbinsyrekoncentration på 0,1 mg/g og frysetørret GL-pulver på 2 g. Det er interessant, at den optimale enzymatiske hydrolysetemperatur for denne undersøgelse er 70 °C. Der er forskningsrapporter om, at temperaturområdet for enzymatisk hydrolyse af planteisothiocyanater fra broccoli er 20-60 °C, hvor den optimale enzymatiske hydrolysetemperatur er 40 °C; temperaturområdet for udvinding af isothiocyanater fra wasabi-rødder er 30-90 °C, og den optimale enzymatiske hydrolysetemperatur er 70 °C. Derfor varierer den optimale temperatur for myrosinase afhængigt af oprindelsesarten.

Normalt varierer de dannede typer isothiocyanater afhængigt af betingelserne for enzymatisk hydrolyse. Chen et al. brugte endogen enzymatisk hydrolyse til at identificere de enzymatiske hydrolyseprodukter i broccoli som allylisothiocyanat, isobutylisothiocyanat, 1-butenylisothiocyanat, 4-methylthionitril, 5-methylthiopentonitril, 3-(methylthio)propylisothiocyanat, 5-methylthiopentonitril, 3-(methylthio)propylisothiocyanat, butylisothiocyanat, radise-thiocyanat og radise-sulforafan ved hjælp af GC-MS, hvor radise-sulforafan havde det højeste indhold. Yang brugte eksogen enzymatisk hydrolyse til at identificere de enzymatiske hydrolyseprodukter i broccoli som allylisothiocyanat, phenethylisothiocyanat, cyclopentylisothiocyanat, phenylpropanonitril, 2,1-phenyloxazolidinone og skjoldbruskkirtelstimulerende hormon. Denne undersøgelse analyserede sammensætningen af de optimale enzymatiske hydrolysebetingelser for BRIe ved hjælp af GC-MS og identificerede syv enzymatiske hydrolyserelaterede produkter, nemlig 3-amino-2-oxazolidinon, 2-oxazolidinethion, 3-buten-1-ylisothiocyanat (BITC), phenylisothiocyanat (PEITC), 1-isothiocyanatpropylester, isothiocyanatisopropylester og 2-phenylisothiocyanat (2-PITC), hvoraf 4 var isothiocyanattyper.

Mange undersøgelser har vist, at isothiocyanater kan forhindre forekomsten af forskellige kræftformer. Forskning har vist, at PEITC-dosisafhængigt hæmmer spredningen af musens osteosarkomcellelinje K7M2 og kan forårsage G2/M-cellecyklusstop og apoptose; BITC kan reducere cellelevedygtigheden af gastrisk adenocarcinomcelle AGS betydeligt og fremkalde apoptose og autofagi. Der er dog i øjeblikket kun få rapporter om isothiocyanaters virkninger og mekanismer på livmoderhalskræft. Denne undersøgelse fandt gennem en in vitro-cellemodel, at BRIe signifikant hæmmede spredningen af livmoderhalskræftceller Hela, Siha og U14 på en tids- og dosisafhængig måde. Ved at sammenligne 24-timers IC50-værdierne for disse tre celletyper konkluderes det, at Hela-celler er de mest følsomme over for BRIe. Ukontrolleret celleproliferation er den grundlæggende årsag til kræft, som skyldes forstyrrelse af cellecyklussen. Flowcytometrianalyse afslørede, at BRIe kan standse Hela-cellecyklussen i S- og G2/M-faserne. Metastasering af kræftceller har altid været et hotspot for forskningen og en udfordring for den kliniske behandling. Gennem scratch-eksperimenter blev det konstateret, at BRIe effektivt kan hæmme Hela-cellers migration. Hochest 33258-farvning afslørede, at BRIe kan fremkalde DNA-kondensation i Hela-cellekerner, og der kan observeres synlig granulær fluorescens i kernerne, hvilket tyder på, at det er et apoptotisk legeme. Yderligere analyse ved hjælp af Annexin V-FITC-dobbeltfarvning afslørede, at apoptosehastigheden for Hela-celler behandlet med BRIe steg med stigende koncentration efter 24 timer, hvilket indikerer, at BRIe inducerede apoptose i Hela-celler. Sammenfattende udviser BRIe betydelig aktivitet mod livmoderhalskræft. Baseret på GC-MS-data spekuleres der i, at BITC, PEITC, isopropylisothiocyanat og 2-PITC kan være de vigtigste aktive ingredienser, som skal valideres yderligere gennem in vitro- og in vivo-eksperimenter.

Sammenfattende har denne undersøgelse for første gang bestemt den optimale fremstillingsproces for eksogen enzymatisk hydrolyse af isothiocyanater i Chamagu. Syv enzymatiske hydrolyse-relaterede produkter blev identificeret gennem GC-MS-analyse, og det opnåede enzymatiske hydrolyseprodukt BRIe har evnen til at hæmme spredningen af livmoderhalskræftceller, undertrykke cellemigration, inducere cellecyklusstop og apoptose. Forskningen giver et referencegrundlag for yderligere udvikling og udnyttelse af Chamagu-planteressourcer. Forskningsresultaterne blev offentliggjort i 6. udgave af Natural Product Research and Development i 2024.