Morchella edulis'ten türetilen bir peptit olan MIP-16'nın saflaştırılması ve nöroprotektif aktivitesi
Parkinson hastalığı (PH), 65 yaş ve üzeri bireyler arasında 2% ila 3% prevalans oranıyla insanlardaki en büyük ikinci nörodejeneratif hastalıktır. PH'nin patolojik özellikleri, substantia nigra pars compacta'da çok sayıda dopaminerjik nöronun kaybı, substantia nigra ve striatumda dopamin biyosentezinde azalmaya yol açması olarak özetlenebilir. PH'nin patojenik mekanizması henüz net değildir. Çalışmalar, çevresel faktörlerin, genetik faktörlerin, oksidatif stresin ve diğer faktörlerin PH'da dopaminerjik nöronların dejenerasyonu ve ölümünde rol oynayabileceğini doğrulamıştır. Bunlar arasında oksidatif stres, nöronal dejenerasyon ve dejenerasyonun önemli bir nedenidir. Bir yandan, beyin insanların normal fizyolojik aktivitelerinde en yüksek oksijen tüketimine sahip organdır, ancak beyindeki antioksidan enzimlerin göreceli eksikliği onu oksidatif stres hasarına karşı çok hassas hale getirir; Öte yandan, ilk çalışmalar substantia nigra pars compacta'daki dopaminerjik nöronlarda mitokondriyal oksidatif stresin artmasının, Parkinson hastalığının iki ana patolojik özelliği olan lizozomal disfonksiyon ve alfa sinüklein birikimine yol açan dopamine bağlı bir toksik kaskadı tetikleyebileceğini göstermiştir. Şu anda, PH tedavisinde tıpta çoğunlukla L-3,4-dihidroksifenilalanin (L-DOPA) takviyesi gibi klasik dopamin replasman tedavisi kullanılmaktadır. Ancak giderek daha fazla sayıda çalışma bu klasik tedavinin önemli yan etkileri olduğunu ortaya koymuştur. Klinik gözlemler, uzun süreli L-DOPA tedavisinin PH hastalarında hareket bozukluklarına neden olma olasılığının bulunduğunu ortaya koymuştur. Bu nedenle, oksidatif stresi azaltmaktan başlamak ve yeni nöroprotektif ajanlar aramak, PH'yi önlemenin ve tedavi etmenin potansiyel yollarından biridir.
Son yıllarda, doğal ürünlerden antioksidan aktiviteye sahip nöroprotektif ajanların çıkarılması ve saflaştırılması yaygın ilgi görmüş ve önemli ilerlemeler kaydedilmiştir. Sedaceae familyasından bir bitki olan Rhodiola rosea L.'nin köklerinden elde edilen salidrosid, apoptotik PC12 hücrelerini korumak için oksidatif stresi ve enflamasyonu inhibe edebilir. Paeoniflorin, NF - κ B aktivasyonunu inhibe ederek PC12 hücrelerinde 6-hidroksidopamin kaynaklı apoptozu hafifletir. Bununla birlikte, bitkilerle karşılaştırıldığında, mantar nöroprotektif ajanları hakkında nispeten daha az araştırma vardır. Bazı fungal polisakkaritler iyi serbest radikal temizleme aktivitesi sergileyebilir ve nöroprotektif etkiler gösterebilir. Bununla birlikte, mantar polisakkaritlerinin büyük bir moleküler ağırlığa, karmaşık bir yapıya sahip olması ve kan-beyin bariyerine nüfuz etmelerinin zor olması, nöroprotektif ajanlar olarak uygulamalarını sınırlamaktadır. Bazı mantarların etanol veya su özütleri nöroprotektif faktörler içerir, ancak özütlerin bileşimi hala belirsizdir ve fonksiyonel maddelerin yapısının tanımlanması gerekir.
Morchella spp. değerli bir yenilebilir ve tıbbi mantardır ve Compendium of Materia Medica'da "tatlı ve soğuk, toksik olmayan, balgam çözücü ve qi düzenleyici ve gastrointestinal sisteme faydalı" olarak kaydedilmiştir. Morchella importuna M. Kuo. Çin'de yaygın olarak yetiştirilen bir çeşittir. Önceki araştırmamızda, Morchella importuna'nın su özütünün, PC12 hücrelerinin farklılaşmasını ve sinir ağları oluşturmasını teşvik edebilen sinir büyüme faktörüne (NGF) benzeyen bir madde içerdiği doğrulanmıştır. Buna dayanarak, bu çalışma Morchella prolifera'nın meyve gövdesindeki fonksiyonel bileşenleri daha da saflaştırdı ve tanımladı, 6-OHDA ile hasar görmüş bir PC12 hücre modeli oluşturdu, Morchella prolifera'nın meyve gövdesindeki fonksiyonel bileşenlerin nöroprotektif aktivitesini doğruladı, yapay olarak yetiştirilen Morchella prolifera'nın sağlık yararlarının geliştirilmesi için veri sağladı ve mantar kaynaklı nöroprotektif ajanların taranması için alternatif kaynaklar sağladı.

Bazı büyük mantarlar son derece yüksek gıda ve tıbbi değere sahiptir ve protein açısından zengindir, bu da onları doğal peptitler elde etmek için ideal hammaddeler haline getirir. Cordymin, Cordyceps sinensis'ten ekstrakte edilen bir peptittir ve inflamasyonu inhibe edebilir ve sıçanlarda iskemi ve hipoksinin neden olduğu beyin hasarını hafifletebilir. Pleurotus eryngii miselyumundan izole edilen PEMP peptidi antioksidan, anti-tümör ve bağışıklık arttırıcı işlevlere sahiptir. Şu anda, mantarların aktif bileşenleri esas olarak polisakkaritlerin araştırılmasına odaklanmıştır. Mantar polisakkaritleriyle karşılaştırıldığında, peptitler basit bir yapıya, düşük immünojeniteye sahiptir ve yapay olarak sentezlenmeleri kolaydır, bu da onları modern ilaç geliştirmenin oldukça umut verici bir parçası haline getirir. Günümüzde, polipeptitleri protein hidrolizatlarından ayırmak ve saflaştırmak için genellikle iyon değişim kromatografisi ve/veya jel filtrasyon kromatografisi dahil olmak üzere kromatografik kolon yöntemleri kullanılmaktadır. Birincisi iyonların ve polar moleküllerin yüküne göre ayrılabilirken, ikincisi moleküler boyuta göre ayrılabilir. Bununla birlikte, şu anda mantar peptitlerinin ekstraksiyonu için standart yöntemler hakkında herhangi bir rapor bulunmamaktadır ve ekstraksiyon tamponunun pH değeri ve ekstraksiyon işlemi sırasında proteaz hidrolizinin gerekli olup olmadığı araştırılmamıştır. Buna ek olarak, farklı mantar türlerinden peptitlerin çıkarılması genellikle farklı ekstraksiyon yöntemlerine karşılık gelir ve bu da mantar peptitlerinin tanıtımına ve uygulanmasına elverişli değildir. Fungal polisakkarit olgunluğu için standart ekstraksiyon yöntemiyle karşılaştırıldığında, fungal peptitlerin ekstraksiyon yöntemi için daha fazla araştırmaya ihtiyaç vardır. Bu çalışmada, MIP-16, moleküler dışlama kromatografisi ve ters yüksek performanslı sıvı kromatografisinin bir kombinasyonu kullanılarak saflaştırılmıştır. Yöntem önce molekülleri boyutlarına göre kabaca ayırdı ve ardından polaritelerine göre alt bölümlere ayırdı. Deney, bu yöntemin iyi bir ayırt edilebilirliğe sahip olduğunu kanıtlamıştır, ancak gereken deney süresi nispeten uzundur ve daha fazla iyileştirmeye ihtiyaç vardır.
Substantia nigra striatumdaki dopaminerjik nöronların dejenerasyonu ve hücre ölümü, Parkinson hastalığının ana nedeni olan dopamin eksikliğine yol açar. Bu nedenle, dopamin replasman tedavisi (L-DOPA takviyesi gibi) şu anda idiyopatik Parkinson hastalığını tedavi etmek için en iyi yöntemlerden biridir ve eksojen dopamin takviyesi yoluyla semptomları hafifletir. Bununla birlikte, ilk optimal tedavi yanıt döneminden sonra, uzun süreli L-DOPA tedavisi genellikle motor fonksiyon kaybı gibi yan etkilere eşlik eder. Buna ek olarak, araştırmacılar uzun süredir L-DOPA alan Parkinson hastalarının idrarında 6-OHDA tespit etmişlerdir. Bu nedenle, bu çalışmada, PH'nin erken oluşumunu simüle etmek ve yeni nöroprotektif ajanlar aramak için PC12 hücrelerini 6-OHDA ile tedavi ettik. Çalışmamızda, 6-OHDA ile tedavinin PC12 hücrelerinde ROS seviyesini artırdığını ve bunun da hücre apoptozunu tetiklediğini bulduk. Uzun süreli L-DOPA tedavisinin daha fazla 6-OHDA üretebileceğini ve bunun da PH tedavisi üzerinde olumsuz bir geri bildirim düzenleyici etkiye sahip olabileceğini düşünüyoruz. Yukarıdaki analize dayanarak, oksidatif basıncı azaltmaktan ve oksidatif hasarı en aza indirmekten başlayarak, etkili ve güvenli nöroprotektif ajanların taranması beklenmektedir. Yüksek mantarlarda bulunan polisakkaritler, peptitler, triterpenler ve diğer bileşenler iyi antioksidan aktiviteye sahiptir. Bu nedenle, PH'da ilaç taraması için kaynak sağlamak üzere mantarlardan nöroprotektif ajanlar araştırıyoruz.
Oksidasyon reaksiyonları insan yaşam aktiviteleri için enerji sağlayabilir, ancak reaksiyon sırasında üretilen süperoksit anyon radikalleri ve hidroksil radikalleri oksidatif hasara neden olabilir. Endojen antioksidan enzimlerin ve diğer antioksidanların varlığı, normal koşullar altında sabit bir durumu koruyarak ROS üretimini ve tüketimini dengeleme eğilimindedir. Ancak yapılan çalışmalar, yaş arttıkça antioksidan sistemin etkinliğinin giderek azaldığını ortaya koymuştur. Yaşlı popülasyonda, reaktif oksijen türlerindeki artış antioksidan sistemin temizleme kapasitesini aşarak oksidatif strese yol açar ve potansiyel olarak Parkinson hastalığı gibi nörodejeneratif hastalıklara neden olur. Süperoksit dismutaz (SOD), katalaz (CAT), glutatyon peroksidaz (GSH Px) gibi endojen antioksidan enzimler vücudun oksidatif strese karşı doğal savunma sistemidir. 6-OHDA ile muameleden sonra, hücre içi antioksidan enzim aktivitesi önemli ölçüde azalmıştır. Bu zamanda, hücre içi antioksidan enzim sisteminin normal yükü önemli ölçüde aştığı sonucuna varılabilir. 6 saat boyunca MIP-16 ön muamelesi PC12 hücrelerinde endojen antioksidan enzim aktivitesini önemli ölçüde artırmıştır. SOD seviyeleri hücre içi antioksidan enzim sisteminin yükünü ve dolaylı olarak hücre içi serbest radikallerin seviyesini yansıtır. Bu sonuç, MIP-16 ön muamelesinden sonra anyonik süperoksit oluşumunun azaldığını gösterebilir. Ayrıca, GSH Px hücresel antioksidan savunmanın temel bir bileşeni ve ROS için bir elektron donörüdür, bu da MIP-16'nın başka bir detoksifikasyon sistemi olarak GSH metabolizmasını etkileyebileceğini ve 6-OHDA kaynaklı hücre ölümünü önleyebileceğini düşündürmektedir.
Endojen antioksidan enzim sistemi ROS'u zamanında temizleyemediğinde, ROS biyomoleküllere kolayca zarar verebilir ve sonuçta hücre apoptozuna yol açabilir. Bcl-2 ve Bax, sırasıyla Bcl-2 protein ailesindeki en temsili apoptoz inhibe edici genler ve apoptoz teşvik edici genlerdir. Bax geni tarafından kodlanan Bax proteini, Bcl-2 ile heterodimerler oluşturarak Bcl-2'nin ifadesini engelleyebilir. Araştırmalar, Bax/Bcl-2 proteinlerinin oranının hücre apoptoz inhibisyonunun gücünü belirleyen önemli bir faktör olduğunu ve Bax/Bcl-2'nin apoptoz için moleküler bir anahtar olarak da düşünülebileceğini ortaya koymuştur. Bax'ın indüklediği hücre apoptozunun mekanizması, Bax'ın tBid'in etkisi altında mitokondriye girmesi, mitokondriyal membranın geçirgenliğini arttırması ve ardından sitokrom C'yi serbest bırakmasıdır. Sitokrom C'nin serbest bırakılması, Caspase-9'u hedefleyerek ve aktive ederek efektör kaspazların (Caspase-3 gibi) aktivasyonuna yol açan endojen hücre apoptozu yolunda önemli bir adımdır. Bu nedenle, bu çalışmada MIP-16'nın 6-OHDA ile indüklenen hücre apoptozu üzerindeki koruyucu etkisi, Bcl-2 ve Bax ekspresyon seviyelerinin yanı sıra Kaspaz (Kaspaz-3 ve Kaspaz-9) aktivitesini tespit ederek araştırılmıştır. Araştırmamızdan, 6-OHDA'nın MIP-16 ile ön muamelesinin Bcl-2 seviyelerini önemli ölçüde artırdığını ve Bax seviyelerini düşürdüğünü, Caspase-3 ve Caspase-9 aktivitesini ise engellediğini gözlemledik. Bu sonuçlar, MIP-16'nın Bcl-2/Bax oranını düzenleyerek ve Caspase-3/-9 aktivitesini inhibe ederek anti apoptotik etkiler gösterebileceğini düşündürmektedir.
Araştırma sonuçları, MIP-16'nın PC12 hücrelerinde 6-OHDA ile indüklenen apoptoz üzerinde önemli bir inhibitör etkiye sahip olduğunu göstermektedir: SOD, CAT ve GSH Px dahil olmak üzere endojen antioksidan enzim aktivitesini endojen bir antioksidan promotör olarak yeniden şekillendirmek. ROS seviyelerini ve MDA üretimini azaltmak, böylece hücresel oksidasyon seviyelerini düşürmek ve apoptozun başlamasını engellemek. Bax/BCl-2 oranını düzenler, Caspase-9 ve Caspase-3 ekspresyonunu inhibe eder, böylece hücrelerde mitokondriyal apoptoz yolunu bloke eder. MIP-16 basit bir yapıya sahiptir ve yapay olarak sentezlenmesi kolaydır, bu nedenle PH tedavisini hafifletmek ve yardımcı olmak için bir ilaç olarak geliştirilmesi ve kullanılması beklenmektedir.