Chamagu izotiyosiyanatın enzimatik hazırlanması ve anti servikal kanser aktivitesi

Son yıllarda Çin'de kanser görülme oranı hızla artmaktadır ve kanserin önlenmesi ve tedavisi acildir. Araştırmalar, turpgil sebzelerin alımının artırılmasının kanser görülme oranını etkili bir şekilde azaltabileceğini göstermektedir. Brassicaceae sebzeleri, glukozinolatlar (GL'ler) olarak da bilinen bol miktarda glukozinolat içerir. Bitkiler mekanik olarak zarar gördüğünde, GL'ler kendi myrosinazları tarafından hidrolize edilerek izotiyosiyanatlar üretilebilir. İzotiyosiyanatlar, R-N=C=S moleküler formülüne sahip konjuge çift bağ içeren bir bileşik sınıfıdır (R, farklı alkil gruplarını temsil eder). Son yıllarda izotiyosiyanatlar, olağanüstü biyolojik aktiviteleri nedeniyle araştırmaların odak noktası haline gelmiştir. Araştırmalar, izotiyosiyanatların anti-tümör, antibakteriyel, serbest radikal süpürme ve patojen direnci gibi çeşitli biyolojik aktivitelere sahip olduğunu göstermiştir. Sağlık, gıda ve tarım gibi birçok alanda geliştirilmiş ve kullanılmıştır.

Bilimsel adı "şalgam" olan Brassica rapa L., Brassicaceae familyasına ait iki yıllık otsu bir bitkidir. Esas olarak Sincan'daki Tianshan Dağları'nın güneybatısında ve Tarim'in kuzeybatısında dağılım gösterir ve Sincan'daki tüm etnik gruplardan insanlar tarafından yaygın olarak tüketilen yerel bir özel sebzedir. Araştırmalar Chamagu köklerinin bol miktarda GL içerdiğini ortaya koymuştur. Zhuang ve arkadaşları, Sincan şalgamının farklı gelişim aşamalarında ve büyüme dönemlerinde (kökler, gövdeler, yapraklar) GL'lerin türlerini ve içeriklerini analiz etmek için ultra yüksek sıvı kromatografi teknolojisini kullanmıştır. Besinsel büyümenin farklı gelişim aşamalarında glukozinolatların türleri ve kütle fraksiyonlarında belirli farklılıklar olduğunu bulmuşlardır. Bitkilerdeki GL'lerin türleri ve içeriklerindeki farklılıklar, izotiyosiyanatların türleri ve içeriklerinde değişikliklere yol açarak farklı biyolojik aktivitelere neden olacaktır. Sun, Qiamagu tohumlarının dört tip izotiyosiyanat içerdiğini bildirmiştir: fenetil izotiyosiyanat, tert butil izotiyosiyanat, izopropil izotiyosiyanat ve allil izotiyosiyanat.

Şu anda, izotiyosiyanatların hazırlanması esas olarak kimyasal sentez ve enzimatik hidrolizi içermektedir. Bunlar arasında kimyasal sentez yöntemi karmaşık adımlara, birçok ara ürüne sahiptir, çevre dostu değildir ve düşük sentez oranına sahiptir; Enzimatik hidroliz, basit işlem ve nispeten yüksek verim avantajlarına sahip olan izotiyosiyanatları çıkarmak için turpgillerdeki glukozinolat mirosinaz sistemini kullanır. Enzimatik hidroliz, endojen mirosinaz bozunma yöntemi ve eksojen mirosinaz bozunma yöntemi olarak ikiye ayrılır. İzotiyosiyanatları hazırlamak için endojen enzimatik hidrolizi kullanmak, işlem basit olmasına rağmen, bitkilerdeki endojen mirosinaz tamamen serbest bırakılamaz, bu da uzun enzimatik hidroliz süresine ve düşük verime neden olur. Ding, kolza tohumunda endojen ve eksojen enzimler tarafından GL'lerin parçalanmasıyla üretilen izotiyosiyanat miktarını karşılaştırmış ve eksojen mirosinaz tarafından üretilen izotiyosiyanat miktarının endojen mirosinazın 7,6 katı olduğunu bulmuştur. GC-MS tanımlama ve analizi, eksojen mirosinazın çeşitli bozunma ürünlerine, nispeten yüksek içeriğe ve daha az safsızlığa sahip olduğunu göstermiştir.

Bu çalışmada hammadde olarak Chamagu kökü kullanılmış ve Chamagu izotiyosiyanat (BRICe) hazırlamak için eksojen mirosinaz parçalama yöntemi kullanılmıştır. Tek faktörlü tarama temelinde, enzim hidroliz süresi, sıcaklık, pH ve askorbik asit konsantrasyonu önemli etki eden faktörler olarak belirlenmiştir. Ekstraksiyon sürecini optimize etmek için dört faktörlü üç seviyeli ortogonal deney kullanılmıştır. Son olarak, kimyasal bileşimi gaz kromatografisi-kütle spektrometresi (GC-MS) ile analiz edilmiş ve izotiyosiyanatın anti-kanser etkisi incelenmiştir.

Kanser, insan yaşam güvenliğini tehdit eden kötü huylu hastalıklardan biridir. Çok sayıda epidemiyolojik çalışma, daha fazla turpgil sebze tüketmenin kanser riskini etkili bir şekilde azaltabileceğini ortaya koymuştur. İzotiyosiyanat, turpgil sebzelerdeki kendi kendine enzimatik hidroliz ürünlerinden biridir. Araştırmalar, izotiyosiyanatların insan vücudundaki faz II enzimlerini aktive ederek faz I reaksiyonlarının ürünlerinin glukuronik asit ve glutatyon ile bağlanmasına izin verdiğini ve böylece kanserojenlerin vücuttan hızla atılmasını sağladığını göstermiştir. Bu nedenle, izotiyosiyanatlar tıpta bir kanser inhibitörü olarak kullanılabilir. Qiamagu, Sincan'da glukozinolatlar, flavonoidler, izotiyosiyanatlar ve polisakkaritler gibi çeşitli aktif bileşenler içeren tıbbi ve yenilebilir bir bitkidir. Ancak, Qiamagu izotiyosiyanatlarının geliştirilmesi ve kullanımı şu anda yetersizdir. Enzimatik hidroliz şu anda izotiyosiyanatların çıkarılması için çevre dostu bir yöntemdir. Enzimatik hidroliz koşullarının optimize edilmesiyle, yalnızca diğer ikincil metabolitlerin üretimi azaltılmakla kalmaz, aynı zamanda hedef ürünün üretim hızı da hızlandırılabilir ve böylece verim artırılabilir. Jang, Brassicaceae familyasında endojen mirosinaz kullanarak izotiyosiyanatlar hazırlamıştır. Endojen enzim yöntemi basit bir sürece sahip olsa da, bitkilerdeki mirosinaz tamamen serbest bırakılamaz, bu da uzun enzimatik hidroliz süresine ve düşük verime neden olur. Endojen enzimlerle karşılaştırıldığında, izotiyosiyanatları hazırlamak için eksojen enzimlerin kullanılması, eksojen enzimlerin enzimatik hidroliz koşullarını kontrol etmek daha kolaydır, bu da enzimatik hidroliz ürünlerinin türlerindeki değişiklikleri yönlendirmek ve ürün miktarını artırmak için faydalıdır. Bu nedenle, harici enzimatik hidroliz koşullarının optimize edilmesi, izotiyosiyanatların hazırlanmasının anahtarıdır.

Enzimatik hidroliz ürünlerinin oluşumu sadece glukozinolat türüyle ilgili değildir, aynı zamanda hidroliz süresi, hidroliz sıcaklığı, pH, basınç ve Fe2+ varlığını da içerir. Latt é, çözeltinin pH'ı nötr olduğunda, glukozinolatların izotiyosiyanat oluşturmasının uygun olduğunu bulmuştur. Bununla birlikte, pH asidik/alkali olduğunda veya siklik sülfür karakteristik proteinler veya Fe2+ mevcut olduğunda, enzimatik hidroliz ürünleri büyük miktarda nitril oluşturacaktır. Yang, pH, EDTA ve askorbik asit faktörlerini analiz etmek için yanıt yüzeyi metodolojisini kullanmış ve bu üç faktörün izotiyosiyanatın ekstraksiyon miktarı üzerinde önemli bir etkisi olduğunu bulmuştur. Burmeister, askorbik asidin mirosinazın aktif bölgesindeki katalitik baz fonksiyonunun yerini alarak mirosinazın katalitik özelliklerini sergilediğini bulmuştur. Taze brokoliye uygun miktarda askorbik asit eklenmesi, mirosinaz aktivitesini önemli ölçüde artırabilir ve böylece izotiyosiyanat üretimini artırabilir. Bu çalışmada BRIe hazırlamak için eksojen mirosinaz (beyaz hardal tohumlarından elde edilen) parçalama yöntemi kullanılmıştır. Enzimatik hidroliz koşulları tek faktörlü ve ortogonal deneylerle optimize edilmiş ve BRIe'nin ekstraksiyonu üzerinde önemli etkisi olan dört faktör taranmıştır: enzimatik hidroliz süresi, enzimatik hidroliz sıcaklığı, askorbik asit konsantrasyonu ve pH. BRIe için en uygun enzimatik hidroliz koşulları şu şekilde belirlenmiştir: 20 μ L mirosinaz ilavesi, 70 ℃ reaksiyon sıcaklığı, 3 saat reaksiyon süresi, 6,5 pH, 0,1 mg/g askorbik asit konsantrasyonu ve 2 g GLs dondurularak kurutulmuş toz. Bu çalışma için optimum enzimatik hidroliz sıcaklığının 70 ℃ olması ilginçtir. Brokoliden bitki izotiyosiyanatlarının enzimatik hidrolizi için sıcaklık aralığının 20-60 ℃ olduğu ve optimum enzimatik hidroliz sıcaklığının 40 ℃ olduğu; Wasabi köklerinden izotiyosiyanatların çıkarılması için sıcaklık aralığının 30-90 ℃ olduğu ve optimum enzimatik hidroliz sıcaklığının 70 ℃ olduğu araştırma raporları vardır. Bu nedenle, mirosinaz için optimum sıcaklık, menşe türüne bağlı olarak değişir.

Genellikle, oluşan izotiyosiyanat türleri enzimatik hidroliz koşullarına bağlı olarak değişir. Chen ve ark. brokolideki enzimatik hidroliz ürünlerini allil izotiyosiyanat, izobütil izotiyosiyanat, 1-butenil izotiyosiyanat, 4-metiltiyonitril olarak tanımlamak için endojen enzimatik hidrolizi kullanmıştır, 5-metiltiyopentonitril, 3-(metiltiyo) propil izotiyosiyanat, bütil izotiyosiyanat, turp tiyosiyanat ve turp sülforafanı GC-MS kullanarak, en yüksek içeriğe sahip olan turp sülforafanı. Yang, brokolideki enzimatik hidroliz ürünlerini alil izotiyosiyanat, fenetil izotiyosiyanat, siklopentil izotiyosiyanat, fenilpropanonitril, 2,1-feniloksazolidinon ve tiroid uyarıcı hormon olarak tanımlamak için eksojen enzimatik hidroliz kullanmıştır. Bu çalışma, GC-MS kullanarak BRIe için optimal enzimatik hidroliz koşullarının bileşimini analiz etmiş ve 3-amino-2-oksazolidinon, 2-oksazolidinetiyon olmak üzere enzimatik hidrolizle ilgili yedi ürün tanımlamıştır, 3-buten-1-ilizotiyosiyanat (BITC), fenil izotiyosiyanat (PEITC), 1-izotiyosiyanat propil ester, izotiyosiyanat izopropil ester ve 2-fenilizotiyosiyanat (2-PITC), bunlardan 4'ü izotiyosiyanat türleriydi.

Birçok çalışma izotiyosiyanatların çeşitli kanserlerin oluşumunu önleyebileceğini göstermiştir. Araştırmalar PEITC'nin fare osteosarkom hücre hattı K7M2'nin proliferasyonunu doza bağlı olarak inhibe ettiğini ve G2/M hücre döngüsünün durmasına ve apoptoza neden olabileceğini; BITC'nin gastrik adenokarsinom hücresi AGS'nin hücre canlılığını önemli ölçüde azaltabileceğini ve apoptoz ve otofajiyi indükleyebileceğini bulmuştur. Bununla birlikte, izotiyosiyanatların serviks kanseri üzerindeki etkileri ve mekanizmaları hakkında çok az rapor bulunmaktadır. Bu çalışma, in vitro hücre modeli aracılığıyla BRIe'nin servikal kanser hücreleri Hela, Siha ve U14'ün proliferasyonunu zamana ve doza bağlı bir şekilde önemli ölçüde inhibe ettiğini bulmuştur. Bu üç hücre tipinin 24 saatlik IC50 değerleri karşılaştırıldığında, Hela hücrelerinin BRIe'ye en duyarlı hücreler olduğu sonucuna varılmıştır. Kontrolsüz hücre çoğalması, hücre döngüsünün bozulmasına bağlı olan kanserin temel nedenidir. Akış sitometrisi analizi BRIe'nin Hela hücre döngüsünü S ve G2/M aşamalarında durdurabildiğini ortaya koymuştur. Kanser hücrelerinin metastazı her zaman bir araştırma noktası ve klinik tedavi zorluğu olmuştur. Çizme deneyleri sayesinde, BRIe'nin Hela hücrelerinin göçünü etkili bir şekilde engelleyebildiği bulunmuştur. Hochest 33258 boyaması, BRIe'nin Hela hücre çekirdeklerinde DNA yoğunlaşmasını indükleyebileceğini ve çekirdeklerde görünür granüler floresanın gözlenebileceğini ve bunun apoptotik bir cisim olduğunu düşündürdüğünü ortaya koydu. Annexin V-FITC çift boyama kullanılarak yapılan ileri analiz, BRIe ile muamele edilen Hela hücrelerinin apoptoz oranının 24 saat sonra artan konsantrasyonla arttığını ortaya koymuştur, bu da BRIe'nin Hela hücrelerinde apoptozu indüklediğini göstermektedir. Özetle, BRIe önemli bir anti servikal kanser aktivitesi sergilemektedir. GC-MS verilerine dayanarak, BITC, PEITC, izopropil izotiyosiyanat ve 2-PITC'nin, in vitro ve in vivo deneylerle daha fazla doğrulanması gereken ana aktif bileşenleri olabileceği tahmin edilmektedir.

Özetle, bu çalışma ilk kez Chamagu'da izotiyosiyanatların eksojen enzimatik hidrolizi için en uygun hazırlama sürecini belirlemiştir. GC-MS analizi yoluyla enzimatik hidrolizle ilgili yedi ürün tanımlanmıştır ve elde edilen enzimatik hidroliz ürünü BRIe, servikal kanser hücrelerinin çoğalmasını inhibe etme, hücre göçünü baskılama, hücre döngüsünü durdurma ve apoptozu indükleme yeteneğine sahiptir. Araştırma, Chamagu bitki kaynaklarının daha da geliştirilmesi ve kullanılması için bir referans temeli sağlamaktadır. Araştırma sonuçları 2024 yılında Natural Product Research and Development dergisinin 6. sayısında yayımlanmıştır.