Очистка и нейропротекторная активность MIP-16, пептида, полученного из Morchella edulis
Болезнь Паркинсона (БП) - второе по распространенности нейродегенеративное заболевание человека, распространенность которого среди лиц в возрасте 65 лет и старше составляет от 2% до 3%. Патологические характеристики БП можно свести к потере большого количества дофаминергических нейронов в substantia nigra pars compacta, что приводит к снижению биосинтеза дофамина в substantia nigra и стриатуме. Патогенетический механизм БП до сих пор не ясен. Исследования подтвердили, что в дегенерации и гибели дофаминергических нейронов при БП могут участвовать факторы окружающей среды, генетические факторы, окислительный стресс и другие факторы. Среди них окислительный стресс является важной причиной дегенерации и вырождения нейронов. С одной стороны, мозг - это орган с самым высоким потреблением кислорода при нормальной физиологической деятельности человека, но относительный недостаток антиоксидантных ферментов в мозге делает его очень восприимчивым к повреждению окислительным стрессом; С другой стороны, первые исследования показали, что увеличение митохондриального окислительного стресса в дофаминергических нейронах в substantia nigra pars compacta может запустить дофамин-зависимый токсический каскад, приводящий к лизосомальной дисфункции и накоплению альфа-синуклеина, которые являются двумя основными патологическими признаками болезни Паркинсона. В настоящее время в медицине для лечения БП в основном используется классическая заместительная терапия дофамином, например, добавление L-3,4-дигидроксифенилаланина (L-DOPA). Однако все больше исследований показывают, что эта классическая терапия имеет значительные побочные эффекты. Клинические наблюдения показали, что длительное лечение L-DOPA с определенной вероятностью может вызвать двигательные нарушения у пациентов с БП. Поэтому одним из потенциальных путей профилактики и лечения БП является снижение окислительного стресса и поиск новых нейропротекторных средств.
В последние годы выделение и очистка нейропротекторных агентов с антиоксидантной активностью из натуральных продуктов привлекает широкое внимание, и в этой области достигнут значительный прогресс. Салидрозид, выделенный из корней родиолы розовой (Rhodiola rosea L.), растения семейства Sedaceae, может подавлять окислительный стресс и воспаление, защищая апоптотические клетки PC12. Паэонифлорин облегчает 6-гидроксидопамин-индуцированный апоптоз в клетках PC12, подавляя активацию NF - κ B. Однако, по сравнению с растениями, существует относительно меньше исследований по грибковым нейропротекторным агентам. Некоторые грибные полисахариды могут проявлять хорошую активность по уничтожению свободных радикалов и оказывать нейропротекторное действие. Однако грибковые полисахариды имеют большой молекулярный вес, сложную структуру и с трудом проникают через гематоэнцефалический барьер, что ограничивает их применение в качестве нейропротекторных агентов. Этанольные или водные экстракты некоторых грибов содержат нейропротекторные факторы, однако состав экстрактов до сих пор неясен, а структура функциональных веществ нуждается в идентификации.
Morchella spp. - ценный съедобный и лекарственный гриб, который занесен в "Сборник лекарственных средств" как "сладкий и холодный, нетоксичный, рассасывающий мокроту и регулирующий ци, благотворно влияющий на желудочно-кишечный тракт". Morchella importuna M. Kuo. является широко культивируемым сортом в Китае. В наших предыдущих исследованиях было подтверждено, что водный экстракт Morchella importuna содержит вещество, напоминающее фактор роста нервов (NGF), который может способствовать дифференцировке клеток PC12 и формированию нейронных сетей. Исходя из этого, в данном исследовании были очищены и идентифицированы функциональные компоненты в плодовом теле Morchella prolifera, создана модель клеток PC12, поврежденных 6-OHDA, проверена нейропротекторная активность функциональных компонентов в плодовом теле Morchella prolifera, предоставлены данные для разработки полезных свойств искусственно выращенной Morchella prolifera и альтернативные ресурсы для скрининга нейропротекторных агентов грибкового происхождения.

Некоторые крупные грибы обладают чрезвычайно высокой пищевой и лекарственной ценностью и богаты белком, что делает их идеальным сырьем для получения природных пептидов. Кордимин - это пептид, выделенный из Cordyceps sinensis, который способен подавлять воспаление и облегчать повреждение мозга, вызванное ишемией и гипоксией у крыс. Пептид PEMP, выделенный из мицелия Pleurotus eryngii, обладает антиоксидантными, противоопухолевыми и иммуноукрепляющими функциями. В настоящее время активные ингредиенты грибов в основном сосредоточены на исследовании полисахаридов. По сравнению с грибковыми полисахаридами пептиды имеют простую структуру, низкую иммуногенность и легко синтезируются искусственным путем, что делает их весьма перспективной частью современной разработки лекарств. В настоящее время для выделения и очистки полипептидов из белковых гидролизатов часто используются хроматографические колоночные методы, включая ионообменную хроматографию и/или гель-фильтрационную хроматографию. Первые могут быть разделены в соответствии с зарядом ионов и полярных молекул, а вторые - в соответствии с размером молекул. Однако в настоящее время нет сведений о стандартных методах выделения грибных пептидов, не изучен вопрос о значении pH экстракционного буфера и о том, требуется ли гидролиз протеазы в процессе выделения. Кроме того, извлечение пептидов из различных видов грибов часто соответствует различным методам экстракции, что не способствует продвижению и применению грибковых пептидов. По сравнению со стандартным методом экстракции грибных полисахаридов, метод экстракции грибных пептидов нуждается в дальнейшем изучении. В данном исследовании MIP-16 был очищен с помощью комбинации молекулярной эксклюзионной хроматографии и обратной высокоэффективной жидкостной хроматографии. Сначала молекулы грубо разделялись по размеру, а затем подразделялись по полярности. Эксперимент показал, что этот метод обладает хорошей различительной способностью, но время, необходимое для эксперимента, довольно велико, и требуется дальнейшее усовершенствование.
Дегенерация и гибель клеток дофаминергических нейронов в стриатуме substantia nigra приводят к дефициту дофамина, что является основной причиной болезни Паркинсона. Поэтому заместительная терапия дофамином (например, добавление L-DOPA) в настоящее время является одним из лучших методов лечения идиопатической болезни Паркинсона, который облегчает симптомы за счет введения экзогенного дофамина. Однако после первоначального периода оптимальной реакции на лечение длительный прием L-DOPA часто сопровождается побочными эффектами, такими как потеря двигательной функции. Кроме того, ученые обнаружили 6-OHDA в моче пациентов с болезнью Паркинсона, которые длительное время принимали L-DOPA. Поэтому в данном исследовании мы обработали клетки PC12 6-OHDA для имитации раннего развития БП и поиска новых нейропротекторных агентов. В нашем исследовании мы обнаружили, что лечение 6-OHDA повышает уровень ROS в клетках PC12, что, в свою очередь, запускает апоптоз клеток. Мы предполагаем, что длительное лечение L-DOPA может привести к образованию большего количества 6-OHDA, что может оказать негативный эффект обратной связи на лечение БП. Исходя из вышеприведенного анализа, начиная со снижения окислительного давления и минимизации окислительного повреждения, можно ожидать поиска эффективных и безопасных нейропротекторных агентов. А полисахариды, пептиды, тритерпены и другие компоненты, содержащиеся в высших грибах, обладают хорошей антиоксидантной активностью. Поэтому мы ведем поиск нейропротекторных агентов из грибов, чтобы обеспечить ресурсы для поиска лекарств при БП.
Реакции окисления могут обеспечить человека энергией для жизнедеятельности, но образующиеся в ходе реакций супероксид-анион-радикалы и гидроксильные радикалы могут вызывать окислительные повреждения. Присутствие эндогенных антиоксидантных ферментов и других антиоксидантов уравновешивает производство и потребление ROS, поддерживая устойчивое состояние в нормальных условиях. Однако исследования показали, что с возрастом эффективность антиоксидантной системы постепенно снижается. У пожилых людей увеличение количества реактивных видов кислорода превышает способность антиоксидантной системы к клиренсу, что приводит к окислительному стрессу и потенциально может стать причиной нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Паркинсона. Эндогенные антиоксидантные ферменты, включая супероксиддисмутазу (СОД), каталазу (КАТ), глутатионпероксидазу (GSH Px) и т.д., являются естественной системой защиты организма от окислительного стресса. После обработки 6-OHDA активность внутриклеточных антиоксидантных ферментов значительно снижалась. Можно сделать вывод, что в это время внутриклеточная антиоксидантная ферментная система значительно превышает нормальную нагрузку. Предварительная обработка MIP-16 в течение 6 часов значительно повышала активность эндогенных антиоксидантных ферментов в клетках PC12. Уровень СОД отражает нагрузку на внутриклеточную антиоксидантную ферментную систему и косвенно отражает уровень внутриклеточных свободных радикалов. Этот результат может свидетельствовать о том, что генерация анионного супероксида снижалась после предварительной обработки MIP-16. Кроме того, GSH Px является основным компонентом клеточной антиоксидантной защиты и донором электронов для ROS, что позволяет предположить, что MIP-16, как еще одна система детоксикации, может влиять на метаболизм GSH и предотвращать 6-OHDA-индуцированную гибель клеток.
Когда эндогенная антиоксидантная ферментная система не может своевременно очистить ROS, ROS легко повреждает биомолекулы, что в конечном итоге приводит к апоптозу клеток. Bcl-2 и Bax - наиболее представительные гены, ингибирующие апоптоз, и гены, способствующие апоптозу, в семействе белков Bcl-2 соответственно. Белок Bax, кодируемый геном Bax, может образовывать гетеродимеры с Bcl-2, подавляя экспрессию Bcl-2. Исследования показали, что соотношение белков Bax/Bcl-2 является ключевым фактором, определяющим силу ингибирования клеточного апоптоза, а Bax/Bcl-2 также можно рассматривать как молекулярный переключатель апоптоза. Механизм индуцированного Bax клеточного апоптоза заключается в том, что Bax проникает в митохондрии под действием tBid, увеличивает проницаемость митохондриальной мембраны, а затем высвобождает цитохром С. Высвобождение цитохрома С является ключевым шагом в эндогенном пути клеточного апоптоза, который происходит путем нацеливания и активации каспазы-9, что приводит к активации эффекторных каспаз (таких как каспаза-3). Поэтому в данном исследовании изучался защитный эффект MIP-16 на 6-OHDA-индуцированный апоптоз клеток путем определения уровня экспрессии Bcl-2 и Bax, а также активности каспаз (каспазы-3 и каспазы-9). В результате нашего исследования мы обнаружили, что предварительная обработка 6-OHDA препаратом MIP-16 значительно повышала уровень Bcl-2 и снижала уровень Bax, а также подавляла активность каспазы-3 и каспазы-9. Эти результаты позволяют предположить, что MIP-16 может оказывать антиапоптотическое действие, регулируя соотношение Bcl-2/Bax и ингибируя активность Caspase-3/-9.
Результаты исследования показывают, что MIP-16 оказывает значительное ингибирующее действие на 6-OHDA-индуцированный апоптоз в клетках PC12: перестраивает активность эндогенных антиоксидантных ферментов, включая SOD, CAT и GSH Px, являясь эндогенным антиоксидантным промотором. Снижение уровня ROS и выработки MDA, тем самым снижая уровень клеточного окисления и ингибируя инициацию апоптоза. Регулирует соотношение Bax/BCl-2, ингибирует экспрессию каспазы-9 и каспазы-3, тем самым блокируя митохондриальный путь апоптоза в клетках. MIP-16 имеет простую структуру и легко синтезируется искусственным путем. Ожидается, что он будет разработан и использован в качестве препарата для облегчения и помощи в лечении БП.