Изучение механизма действия дигидромирицетина в улучшении фиброза почек у мышей db/db на основе сетевой фармакологии и экспериментальной проверки
Диабетическая нефропатия (ДН) - одно из основных микрососудистых осложнений сахарного диабета 2 типа (СД2) и главная причина развития болезни почек в конечной стадии. Ее основными характеристиками являются утолщение гломерулярной базовой мембраны, расширение брыжейки и тубулоинтерстициального матрикса, а также потеря подоцитов, что приводит к развитию микроальбуминурии и снижению функции почек. При постоянном развитии диабетической болезни почек (ДБП) микроструктура почечной ткани подвергается постоянному воспалению и повреждению, что приводит к диффузному интерстициальному фиброзу, разрушающему нормальную микроструктуру почек и в конечном итоге перерастающему в почечный фиброз (ПФ). В настоящее время средства для облегчения прогрессирования ДКД в РФ в основном направлены на улучшение ДКД. Однако механизм большинства осложнений диабета, включая ДКД, еще не выяснен, поэтому сложный механизм перерастания ДКД в РФ не ясен, что приводит к неудовлетворительному терапевтическому эффекту ДКД и РФ. Поэтому необходимо срочно изучить патогенез ДКД и найти новые терапевтические мишени для подавления его развития.
Дигидромирицетин (DHM) - это природное флавоноидное соединение с различными фармакологическими эффектами, включая противовоспалительный, антиоксидантный, сжигающий свободные радикалы, улучшающий митохондриальную дисфункцию и регулирующий аутофагию. В настоящее время многочисленные исследования показали, что DHM обладает большим потенциалом в лечении метаболических заболеваний. Он может не только улучшить инсулинорезистентность и снизить уровень глюкозы в крови за счет индуцирования аутофагии, улучшения окислительного стресса, подавления воспаления и повышения активности митохондрий, но и одновременно улучшить многие осложнения диабета, такие как диабетическая энцефалопатия, диабетическая кардиомиопатия и т.д. Тем не менее, исследований по улучшению осложнений диабета с помощью DHM недостаточно, и связанный с этим фармакологический механизм еще нуждается в дальнейшем изучении. Кроме того, существует ограниченное количество исследований о том, может ли DHM еще больше улучшить РФ, вызванную DHM, и терапевтический эффект все еще неясен.
Сетевая фармакология может построить сеть взаимодействия "лекарственный компонент-мишень-болезнь" на основе структуры компонентов традиционной китайской медицины, их биологических эффектов и связанных с болезнью мишеней в контексте обширной сети биологических процессов. Это эффективное средство для изучения эффективных компонентов, молекулярных механизмов и потенциальных мишеней традиционной китайской медицины. Молекулярный докинг позволяет моделировать взаимодействие между молекулами и белками, предсказывать конформацию лигандов и рецепторов, рассчитывать и прогнозировать сродство и режимы связывания для проверки конкретного способа действия компонентов лекарств на основные мишени. Поэтому в данном исследовании использовалась сетевая фармакология для скрининга и прогнозирования потенциальных мишеней ДГМ при ДКД и РФ, была построена сеть взаимодействия "компонент-мишень-болезнь" и проведена проверка предсказанных основных мишеней с помощью молекулярного докинга и экспериментов in vivo. Был изучен молекулярный механизм улучшения дигидромирицетином фиброза почек у мышей db/db, что послужило теоретической основой для клинического применения DHM.

 

В настоящее время общепринятое лечение диабета в основном зависит от контроля уровня сахара в крови, в то время как ДКД, одно из самых серьезных осложнений диабета, не имеет эффективной стратегии лечения. Поэтому очень важно глубоко понять патогенез ДКД и найти эффективные стратегии лечения, чтобы подавить тенденцию перерастания ДКД в фиброз почек. Было доказано, что природные лекарства обладают уникальными преимуществами - меньшим количеством побочных эффектов и многоцелевой эффективностью, что делает их важным источником для разработки новых лекарств от хронических заболеваний в последние годы. Дальнейшие исследования DHM выявили значительный терапевтический потенциал в улучшении метаболических заболеваний. Поэтому, основываясь на улучшении фиброза почек у мышей db/db с помощью DHM, данное исследование объединяет сетевую фармакологию и технологию молекулярного докинга для изучения потенциальных терапевтических мишеней и молекулярных механизмов DHM в улучшении фиброза почек у мышей db/db, и проверяет их с помощью экспериментов на животных.

Во-первых, мы заметили, что 10-недельное вмешательство DHM эффективно снижает уровень глюкозы в крови, массу тела, креатинин, азот мочевины, белок мочи и почечные патологические проявления у мышей db/db, что свидетельствует о том, что DHM может облегчить повреждение почечной функции и замедлить развитие ДКД у мышей db/db. После анализа и скрининга 37 пересекающихся мишеней DHM, DKD и RF было обнаружено, что 10 мишеней, включая AKT1, ALB, CASP3, EGFR, MMP9, IGF1, PPARG, KDR, MMP2, ACE, могут быть ключевыми мишенями для DHM для улучшения DKD. Было подтверждено, что AKT1, CASP3, EGFR, MMP9, IGF1, MMP2, ACE активируются в условиях диабета, и специфическое ингибирование может улучшить поврежденное состояние ДКД и замедлить тенденцию развития фиброза. PPARG и KDR ингибируются в физиологической среде диабета и играют роль в защите почек после активации. ALB - важный биохимический показатель, позволяющий наблюдать за степенью повреждения почек при развитии диабета. Обычно он повышается при возникновении ДКД и снижается после улучшения ДКД. Это означает, что 10 ключевых генов, которые мы проверили, могут служить не только потенциальными биомаркерами ДКД, но и ключевыми мишенями для дальнейшего изучения патогенеза и лечения ДКД.

Анализ обогащения KEGG-путей показал, что в улучшении влияния DHM на ДКД могут участвовать сигнальный путь AGE-RAGE, кардиомиопатия диабета и сигнальный путь FoxO. Сигнальный путь AGE-RAGE и сигнальный путь FoxO играют ключевую регуляторную роль в развитии ДКД. Исследования показали, что AGEs специфически активируются в эндотелиальных клетках, почечных канальцах, мезангиальных клетках и подоцитах пациентов с ДКД, а их взаимодействие с RAGE усиливается, что еще больше усугубляет окислительный стресс и воспаление в почках, приводя к ухудшению ДКД. Кроме того, активированный FoxO3a может подавлять уровень окислительного стресса в почках крыс с диабетом, улучшать воспаление, а затем препятствовать возникновению ДКД. Это указывает на то, что специфическая регуляция сигнального пути AGE-RAGE или сигнального пути FoxO может иметь большое значение для профилактики и лечения ДКД.

Результаты молекулярного докинга показали, что DHM демонстрирует хорошее сродство к 5 выбранным мишеням, что свидетельствует о том, что эффективность DHM в лечении ДКД была подтверждена на молекулярном уровне. Кроме того, мы заметили, что ключевой ген-мишень AKT1, который занял первое место в скрининге, был тесно связан с сигнальным путем AGE-RAGE и сигнальным путем FoxO в развитии ДКД через анализ обогащения KEGG-пути. Сигнальный путь AGE-RAGE может взаимодействовать с сигнальным путем PI3K/Akt, вызывая окислительный стресс и хроническое воспаление в почках, что приводит к заболеванию почек. Активация пути PI3K/Akt/FoxO3a может улучшить физиологическую функцию почек при диабете. Поэтому мы попытались исследовать взаимодействие между Notch-путем, предшествующим AKT1, и DHM и провели молекулярное докирование. Результаты молекулярного докинга показали, что DHM обладает хорошим сродством к связыванию с Notch1 и PTEN.

Предыдущие исследования показали, что путь Notch чрезмерно активируется во время развития ДКД, что проявляется в повышенной экспрессии Notch1, NICD, Hes1 и Hey1. Ингибиторы Notch1 могут активировать PTEN, снижая активацию Hes1, тем самым улучшая нарушения аутофагии и замедляя возникновение РФ. Кроме того, другие исследования показали, что активация PTEN может также облегчить прогрессирование ДКД путем ингибирования пути PI3K/Akt. Основываясь на вышеприведенных результатах, мы предположили, что DHM может улучшить ДКД путем регулирования пути Notch/PTEN/AKT. Результаты вестерн-блота показали аномальное увеличение активации пути Notch, снижение экспрессии PTEN и увеличение фосфорилирования AKT в почках мышей db/db. А прием DHM может подавлять активацию Notch-пути, активировать PTEN и ингибировать фосфорилирование AKT. Хотя сигнальная ось Notch/PTEN/AKT как целостный путь редко изучалась в отношении защиты почек при диабете, наше исследование в определенной степени улучшило соответствующие исследования и обогатило молекулярный механизм биологической защиты DHM через многочисленные мишени.

В итоге, основываясь на наблюдении улучшения патологических проявлений ДКД, данное исследование объединило сетевую фармакологию и технологию молекулярного докинга, чтобы предварительно продемонстрировать, что роль DHM в улучшении прогрессирования ДКД может быть достигнута через ключевые мишени, такие как AKT1, ALB, CASP3, EGFR, MMP9, IGF1, PPARG, KDR, MMP2, ACE, и проанализировать соответствующие пути; Наконец, была проведена предварительная проверка и анализ потенциальных AKT-мишеней DHM с помощью экспериментов на животных, и было установлено, что DHM может играть роль в профилактике и лечении ДКД, регулируя Notch/PTEN/AKT-путь (см. рис. 14). Однако в настоящее время существует относительно мало исследований, посвященных осложнениям ДГМ при СД2, и его терапевтический потенциал все еще нуждается в дальнейшем изучении.