Ферментативное получение и активность изотиоцианата чамагу против рака шейки матки

В последние годы уровень заболеваемости раком в Китае стремительно растет, и профилактика и лечение рака являются неотложной задачей. Исследования показывают, что увеличение потребления крестоцветных овощей может эффективно снизить уровень заболеваемости раком. Овощи семейства крестоцветных содержат большое количество глюкозинолатов, также известных как глюкозинолаты (GLs). Когда растения получают механические повреждения, GLs могут быть гидролизованы собственной мирозиназой с образованием изотиоцианатов. Изотиоцианаты - это класс соединений, содержащих сопряженные двойные связи, с молекулярной формулой R-N=C=S (R представляет собой различные типы алкильных групп). В последние годы изотиоцианаты стали объектом пристального внимания исследователей благодаря своей выдающейся биологической активности. Исследования показали, что изотиоцианаты обладают различными видами биологической активности, такими как противоопухолевая, антибактериальная, сжигающая свободные радикалы и устойчивость к патогенам. Они были разработаны и использованы во многих областях, таких как здравоохранение, пищевая промышленность и сельское хозяйство.

Brassica rapa L., научное название "репа", - это двулетнее травянистое растение, принадлежащее к семейству Brassicaceae. Оно распространено в основном на юго-западе гор Тяньшань и северо-западе Тарима в Синьцзяне и является местным деликатесным овощем, который обычно употребляют люди всех этнических групп Синьцзяна. Исследования показали, что корни чамагу содержат большое количество GL. Чжуан и др. использовали технологию сверхвысокой жидкостной хроматографии для анализа типов и содержания GLs в различных стадиях развития и частях роста (корни, стебли, листья) синьцзянской репы в период ее пищевого роста. Было установлено, что существуют определенные различия в типах и массовых долях глюкозинолатов на разных стадиях развития питательного роста. Различия в типах и содержании ГЛ в растениях приводят к изменениям в типах и содержании изотиоцианатов, что приводит к различным биологическим действиям. Сунь сообщил, что семена циамагу содержат четыре типа изотиоцианатов: фенетил изотиоцианат, трет-бутил изотиоцианат, изопропил изотиоцианат и аллил изотиоцианат.

В настоящее время для получения изотиоцианатов используются в основном химический синтез и ферментативный гидролиз. Среди них метод химического синтеза имеет сложные этапы, множество промежуточных продуктов, не является экологически чистым и имеет низкую скорость синтеза; ферментативный гидролиз использует систему глюкозинолатной мирозиназы в крестоцветных растениях для извлечения изотиоцианатов, которая имеет преимущества простой операции и относительно высокого выхода. Ферментативный гидролиз подразделяется на метод деградации эндогенной мирозиназы и метод деградации экзогенной мирозиназы. При использовании эндогенного ферментативного гидролиза для получения изотиоцианатов, несмотря на простоту процесса, эндогенная мирозиназа в растениях не может быть полностью высвобождена, что приводит к длительному времени ферментативного гидролиза и низкой эффективности. Динг сравнил количество изотиоцианатов, образующихся при деградации GLs эндогенными и экзогенными ферментами в рапсе, и обнаружил, что количество изотиоцианатов, образующихся под действием экзогенной мирозиназы, в 7,6 раз больше, чем под действием эндогенной мирозиназы. ГХ-МС идентификация и анализ показали, что экзогенная мирозиназа имеет разнообразные продукты деградации, относительно высокое содержание и меньшее количество примесей.

В данном исследовании в качестве сырья использовался корень чамагу, а для получения изотиоцианата чамагу (BRICe) применялся метод деградации экзогенной мирозиназы. На основе однофакторного скрининга были определены время ферментного гидролиза, температура, pH и концентрация аскорбиновой кислоты как значимые факторы влияния. Для оптимизации процесса экстракции был использован четырехфакторный трехуровневый ортогональный эксперимент. Наконец, химический состав был проанализирован методом газовой хроматографии-масс-спектрометрии (ГХ-МС), и был изучен противораковый эффект изотиоцианата.

Рак - одно из злокачественных заболеваний, угрожающих безопасности жизни человека. Многочисленные эпидемиологические исследования показали, что употребление большего количества крестоцветных овощей может эффективно снизить риск развития рака. Изотиоцианат - один из продуктов самоферментативного гидролиза в крестоцветных овощах. Исследования показали, что изотиоцианаты могут активировать ферменты фазы II в организме человека, позволяя продуктам реакций фазы I связываться с глюкуроновой кислотой и глутатионом, тем самым способствуя быстрому выведению канцерогенов из организма. Поэтому изотиоцианаты могут использоваться в медицине в качестве ингибитора рака. Цямагу - лекарственное и съедобное растение в Синьцзяне, содержащее различные активные вещества, такие как глюкозинолаты, флавоноиды, изотиоцианаты и полисахариды. Однако разработка и использование изотиоцианатов Цямагу в настоящее время недостаточны. Ферментативный гидролиз в настоящее время является экологически чистым методом извлечения изотиоцианатов. Оптимизируя условия ферментативного гидролиза, можно не только сократить производство других вторичных метаболитов, но и ускорить производство целевого продукта, тем самым увеличив выход. Джанг получил изотиоцианаты с помощью эндогенной мирозиназы из семейства Brassicaceae. Хотя метод с использованием эндогенных ферментов отличается простотой, мирозиназа в растениях не может быть полностью высвобождена, что приводит к длительному времени ферментативного гидролиза и низкой эффективности. По сравнению с эндогенными ферментами, при использовании экзогенных ферментов для получения изотиоцианатов легче контролировать условия ферментативного гидролиза экзогенными ферментами, что благоприятно для направления изменений в типах продуктов ферментативного гидролиза и увеличения количества продуктов. Поэтому оптимизация внешних условий ферментативного гидролиза является ключом к получению изотиоцианатов.

Образование продуктов ферментативного гидролиза зависит не только от типа глюкозинолата, но и от времени гидролиза, температуры гидролиза, pH, давления и присутствия Fe2+. Latt é обнаружил, что при нейтральном pH раствора глюкозинолаты образуют изотиоцианаты. Однако, если рН кислый/щелочной, или если присутствуют белки, характеризующиеся циклической серой, или Fe2+, продукты ферментативного гидролиза образуют большое количество нитрилов. Янг использовал методологию поверхности отклика для анализа факторов рН, ЭДТА и аскорбиновой кислоты и обнаружил, что эти три фактора оказывают значительное влияние на количество экстрагированного изотиоцианата. Бурмейстер обнаружил, что аскорбиновая кислота замещает функцию каталитического основания в активном сайте мирозиназы, проявляя каталитические свойства мирозиназы. Добавление соответствующего количества аскорбиновой кислоты в свежую брокколи может значительно усилить активность мирозиназы, тем самым увеличивая производство изотиоцианатов. В данном исследовании для получения BRIe использовался метод деградации экзогенной мирозиназы (полученной из семян белой горчицы). Условия ферментативного гидролиза были оптимизированы с помощью однофакторных и ортогональных экспериментов, и были отобраны четыре фактора, которые оказывали значительное влияние на извлечение BRIe: время ферментативного гидролиза, температура ферментативного гидролиза, концентрация аскорбиновой кислоты и pH. Оптимальные условия ферментативного гидролиза для BRIe были определены следующим образом: добавление мирозиназы в количестве 20 мкл, температура реакции 70 ℃, время реакции 3 ч, pH 6,5, концентрация аскорбиновой кислоты 0,1 мг/г, сублимированный порошок GLs 2 г. Интересно, что оптимальная температура ферментативного гидролиза для данного исследования составляет 70 ℃. По данным исследований, диапазон температур для ферментативного гидролиза растительных изотиоцианатов из брокколи составляет 20-60 ℃, а оптимальная температура ферментативного гидролиза - 40 ℃; диапазон температур для извлечения изотиоцианатов из корней васаби составляет 30-90 ℃, а оптимальная температура ферментативного гидролиза - 70 ℃. Таким образом, оптимальная температура для мирозиназы варьируется в зависимости от вида происхождения.

Обычно типы образующихся изотиоцианатов зависят от условий ферментативного гидролиза. Чен и др. использовали эндогенный ферментативный гидролиз, чтобы определить продукты ферментативного гидролиза в брокколи как аллил изотиоцианат, изобутил изотиоцианат, 1-бутенил изотиоцианат, 4-метилтионитрил, 5-метилтиопентонитрил, 3-(метилтио)пропил изотиоцианат, бутил изотиоцианат, тиоцианат редьки и сульфорафан редьки с помощью ГХ-МС, причем сульфорафан редьки имел самое высокое содержание. Янг использовал экзогенный ферментативный гидролиз, чтобы определить продукты ферментативного гидролиза в брокколи как аллил изотиоцианат, фенетил изотиоцианат, циклопентил изотиоцианат, фенилпропанонитрил, 2,1-фенилоксазолидинон и тиреостимулирующий гормон. В данном исследовании был проведен анализ состава оптимальных условий ферментативного гидролиза BRIe с помощью ГХ-МС и выявлено семь продуктов ферментативного гидролиза, а именно 3-амино-2-оксазолидинон, 2-оксазолидинэтион, 3-бутен-1-илизотиоцианат (BITC), фенил изотиоцианат (PEITC), 1-изотиоцианат пропиловый эфир, изотиоцианат изопропиловый эфир и 2-фенилизотиоцианат (2-PITC), из которых 4 были изотиоцианатного типа.

Многие исследования показали, что изотиоцианаты могут предотвращать возникновение различных видов рака. Исследования показали, что PEITC дозозависимо ингибирует пролиферацию клеточной линии остеосаркомы мыши K7M2 и может вызывать остановку клеточного цикла G2/M и апоптоз; BITC может значительно снизить жизнеспособность клеток аденокарциномы желудка AGS и индуцировать апоптоз и аутофагию. Однако в настоящее время имеется мало сообщений о влиянии и механизмах воздействия изотиоцианатов на рак шейки матки. В данном исследовании на клеточной модели in vitro было установлено, что BRIe значительно ингибирует пролиферацию клеток рака шейки матки Hela, Siha и U14 в зависимости от времени и дозы. Сравнивая 24-часовые значения IC50 для этих трех типов клеток, можно сделать вывод, что клетки Hela наиболее чувствительны к BRIe. Неконтролируемая пролиферация клеток является основной причиной развития рака, что связано с нарушением клеточного цикла. Анализ проточной цитометрии показал, что BRIe может арестовывать клеточный цикл Hela в фазах S и G2/M. Метастазирование раковых клеток всегда было актуальной темой исследований и проблемой клинического лечения. В ходе скретч-экспериментов было установлено, что BRIe может эффективно подавлять миграцию клеток Hela. Окрашивание Hochest 33258 показало, что BRIe может вызывать конденсацию ДНК в ядрах клеток Hela, а в ядрах наблюдается видимая гранулярная флуоресценция, что говорит о том, что это апоптотическое тело. Дальнейший анализ с использованием двойного окрашивания Annexin V-FITC показал, что уровень апоптоза клеток Hela, обработанных BRIe, увеличивался с ростом концентрации через 24 часа, что указывает на то, что BRIe индуцирует апоптоз в клетках Hela. Таким образом, BRIe проявляет значительную активность против рака шейки матки. Основываясь на данных ГХ-МС, можно предположить, что основными действующими веществами препарата являются BITC, PEITC, изопропил изотиоцианат и 2-PITC, что требует дальнейшего подтверждения в ходе экспериментов in vitro и in vivo.

Таким образом, в данном исследовании впервые определен оптимальный процесс подготовки к экзогенному ферментативному гидролизу изотиоцианатов в чамагу. Семь продуктов ферментативного гидролиза были идентифицированы с помощью ГХ-МС анализа, а полученный продукт ферментативного гидролиза BRIe обладает способностью ингибировать пролиферацию клеток рака шейки матки, подавлять миграцию клеток, вызывать остановку клеточного цикла и апоптоз. Проведенное исследование создает справочную основу для дальнейшего развития и использования ресурсов растения чамагу. Результаты исследования опубликованы в 6-м выпуске журнала Natural Product Research and Development за 2024 год.