A Chamagu izotiocianát enzimatikus előállítása és méhnyakrákellenes aktivitása

Az utóbbi években a rák előfordulási aránya gyorsan növekszik Kínában, és a rák megelőzése és kezelése sürgős. A kutatások azt mutatják, hogy a keresztesvirágú zöldségek fogyasztásának növelése hatékonyan csökkentheti a rák előfordulási arányát. A keresztesvirágzatú zöldségek bőségesen tartalmaznak glükozinolátokat, más néven glükozinolátokat (GL). Amikor a növények mechanikusan károsodnak, a GL-eket a saját mirozinázuk hidrolizálja izotiocianátok előállítására. Az izotiocianátok a konjugált kettős kötéseket tartalmazó vegyületek osztálya, molekuláris képletük R-N=C=S (az R különböző típusú alkilcsoportokat jelent). Az utóbbi években az izotiocianátok kiemelkedő biológiai aktivitásuk miatt a kutatások fókuszába kerültek. A kutatások kimutatták, hogy az izotiocianátok különböző biológiai aktivitásokkal rendelkeznek, mint például daganatellenes, antibakteriális, szabadgyök-fogó és kórokozóval szembeni ellenállás. Számos területen, például az egészségügyben, az élelmiszeriparban és a mezőgazdaságban fejlesztették ki és használják.

A Brassica rapa L., tudományos nevén "fehérrépa", a Brassicaceae családba tartozó kétéves lágyszárú növény. Főleg a Tianshan-hegység délnyugati részén és a Tarimtól északnyugatra, Hszincsiangban elterjedt, és helyi zöldségkülönlegesség, amelyet Hszincsiangban minden etnikai csoporthoz tartozó emberek általánosan fogyasztanak. A kutatások megállapították, hogy a chamagu gyökerek bőséges GL-t tartalmaznak. Zhuang és munkatársai ultra-nagy folyadékkromatográfiás technológiát alkalmaztak a Xinjiang répa különböző fejlődési szakaszaiban és növekedési részeiben (gyökerek, szárak, levelek) található GL-ek típusainak és tartalmának elemzésére a táplálkozási növekedési időszakban. Megállapították, hogy a glükozinolátok típusai és tömegfrakciói között bizonyos különbségek voltak a tápnövekedés különböző fejlődési szakaszaiban. A növényekben a GL-ek típusainak és tartalmainak különbségei az izotiocianátok típusainak és tartalmainak eltéréseihez vezetnek, ami különböző biológiai aktivitásokat eredményez. Sun arról számolt be, hogy a Qiamagu magvak négyféle izotiocianátot tartalmaznak: fenetil-izotiocianátot, tert-butil-izotiocianátot, izopropil-izotiocianátot és allil-izotiocianátot.

Jelenleg az izotiocianátok előállítása főként kémiai szintézist és enzimatikus hidrolízist foglal magában. Ezek közül a kémiai szintézis módszere bonyolult lépésekkel, sok köztes termékkel jár, nem környezetbarát és alacsony a szintézis sebessége; az enzimatikus hidrolízis a keresztesvirágú növények glükozinolát-mirozináz rendszerét használja az izotiocianátok kivonására, amelynek előnye az egyszerű működés és a viszonylag magas hozam. Az enzimatikus hidrolízist endogén mirozináz lebontási módszerre és exogén mirozináz lebontási módszerre osztják. Az endogén enzimatikus hidrolízis alkalmazása az izotiocianátok előállítására, bár a folyamat egyszerű, a növényekben lévő endogén mirozináz nem tud teljesen felszabadulni, ami hosszú enzimatikus hidrolízis időt és alacsony hatékonyságot eredményez. Ding összehasonlította a repcében az endogén és exogén enzimek által végzett GL-lebontás során keletkező izotiocianátok mennyiségét, és megállapította, hogy az exogén mirozináz által termelt izotiocianátok mennyisége 7,6-szorosa volt az endogén mirozinázénak. A GC-MS azonosítás és elemzés azt mutatta, hogy az exogén mirozináznak sokféle bomlásterméke volt, viszonylag magas tartalommal és kevesebb szennyeződéssel.

Ebben a tanulmányban a Chamagu gyökeret használták nyersanyagként, és exogén mirozináz lebontási módszert alkalmaztak a Chamagu izotiocianát (BRICe) előállításához. Az egytényezős szűrés alapján az enzimhidrolízis ideje, a hőmérséklet, a pH és az aszkorbinsav koncentrációja jelentős befolyásoló tényezőként azonosították. A kivonási folyamat optimalizálására négyfaktoros háromszintű ortogonális kísérletet alkalmaztunk. Végül a kémiai összetételt gázkromatográfia-tömegspektrometriával (GC-MS) elemezték, és tanulmányozták az izotiocianát rákellenes hatását.

A rák az egyik olyan rosszindulatú betegség, amely az emberi élet biztonságát fenyegeti. Több járványtani vizsgálat megállapította, hogy több keresztesvirágú zöldség fogyasztása hatékonyan csökkentheti a rák kockázatát. Az izotiocianát a keresztesvirágú zöldségek önenzimatikus hidrolízisének egyik terméke. A kutatások kimutatták, hogy az izotiocianátok képesek aktiválni a II. fázisú enzimeket az emberi szervezetben, lehetővé téve az I. fázisú reakciók termékeinek a glükuronsavhoz és a glutationhoz való kötődését, ezáltal elősegítve a rákkeltő anyagok gyors kiürülését a szervezetből. Ezért az izotiocianátok rákgátlóként használhatók a gyógyászatban. A Qiamagu egy gyógy- és ehető növény Hszincsiangban, amely különböző hatóanyagokat, például glükozinolátokat, flavonoidokat, izotiocianátokat és poliszacharidokat tartalmaz. A Qiamagu izotiocianátok fejlesztése és felhasználása azonban jelenleg elégtelen. Az enzimatikus hidrolízis jelenleg környezetbarát módszer az izotiocianátok kivonására. Az enzimatikus hidrolízis körülményeinek optimalizálásával nemcsak az egyéb másodlagos metabolitok termelése csökkenthető, hanem a céltermék termelési sebessége is felgyorsítható, ezáltal növelhető a hozam. Jang a Brassicaceae családban endogén mirozinázzal állította elő az izotiocianátokat. Bár az endogén enzimes módszer egyszerű folyamat, a növényekben lévő mirozináz nem tud teljesen felszabadulni, ami hosszú enzimes hidrolízisidőt és alacsony hatékonyságot eredményez. Az endogén enzimekkel összehasonlítva, az exogén enzimek használata az izotiocianátok előállításához könnyebben szabályozható az exogén enzimek enzimatikus hidrolízisének körülményei, ami előnyös az enzimatikus hidrolízis termékeinek típusaiban bekövetkező változások irányítása és a termékek mennyiségének növelése szempontjából. Ezért az izotiocianátok előállításának kulcsa a külső enzimes hidrolízis feltételeinek optimalizálása.

Az enzimatikus hidrolízistermékek képződése nemcsak a glükozinolát típusával függ össze, hanem magában foglalja a hidrolízis idejét, a hidrolízis hőmérsékletét, a pH-t, a nyomást és a Fe2+ jelenlétét is. Latt é megállapította, hogy ha az oldat pH-ja semleges, akkor a glükozinolátok számára kedvező az izotiocianátok képződése. Ha azonban a pH savas/lúgos, vagy ha ciklikus kénre jellemző fehérjék vagy Fe2+ van jelen, az enzimatikus hidrolízis termékei nagy mennyiségű nitrilt képeznek. Yang válaszfelületi módszert használt a pH, az EDTA és az aszkorbinsav tényezőinek elemzésére, és megállapította, hogy ez a három tényező jelentős hatással van az izotiocianát extrakciós mennyiségére. Burmeister megállapította, hogy az aszkorbinsav helyettesítette a katalitikus bázis funkciót a mirozináz aktív helyén, a mirozináz katalitikus tulajdonságait mutatva. Megfelelő mennyiségű aszkorbinsav hozzáadása a friss brokkolihoz jelentősen fokozhatja a mirozináz aktivitását, ezáltal növelve az izotiocianátok termelését. Ez a tanulmány exogén (fehér mustármagból származó) mirozináz lebontási módszert alkalmazott a BRIe előállításához. Az enzimatikus hidrolízis körülményeit egytényezős és ortogonális kísérletekkel optimalizáltuk, és négy olyan tényezőt vizsgáltunk, amelyek jelentős hatással voltak a BRIe kivonására: az enzimatikus hidrolízis ideje, az enzimatikus hidrolízis hőmérséklete, az aszkorbinsav koncentrációja és a pH. A BRIe optimális enzimatikus hidrolízisfeltételeit a következőképpen határozták meg: 20 μ L mirozináz hozzáadása, 70 ℃ reakcióhőmérséklet, 3 óra reakcióidő, 6,5 pH, 0,1 mg/g aszkorbinsav-koncentráció és 2 g GLs fagyasztva szárított por. Érdekes, hogy az optimális enzimatikus hidrolízis hőmérséklete ebben a vizsgálatban 70 ℃. Vannak kutatási jelentések, amelyek szerint a brokkoliból származó növényi izotiocianátok enzimatikus hidrolízisének hőmérsékleti tartománya 20-60 ℃, az optimális enzimatikus hidrolízis hőmérséklete 40 ℃; A wasabi gyökerekből származó izotiocianátok kivonásának hőmérsékleti tartománya 30-90 ℃, az optimális enzimatikus hidrolízis hőmérséklete 70 ℃. A mirozináz optimális hőmérséklete tehát a származási fajtól függően változik.

A képződő izotiocianátok típusai általában az enzimatikus hidrolízis körülményeitől függően változnak. Chen et al. endogén enzimatikus hidrolízist használt, hogy a brokkoliban az enzimatikus hidrolízis termékeiként alil-izotiocianátot, izobutil-izotiocianátot, 1-butenil-izotiocianátot, 4-metil-tionitrilt azonosítsa, 5-metiltiópentonitril, 3-(metiltio-)propil-izotiocianát, butil-izotiocianát, retek-tiocianát és retek-szulforafán GC-MS segítségével, a retek-szulforafán tartalma volt a legmagasabb. Yang exogén enzimatikus hidrolízist alkalmazott, hogy a brokkoliban lévő enzimatikus hidrolízis termékei az alil-izotiocianát, fenetil-izotiocianát, ciklopentil-izotiocianát, fenilpropanonitril, 2,1-feniloxazolidinon és pajzsmirigy-stimuláló hormon. Ez a tanulmány GC-MS segítségével elemezte a BRIe optimális enzimatikus hidrolízisfeltételeinek összetételét, és hét enzimatikus hidrolízishez kapcsolódó terméket azonosított, nevezetesen 3-amino-2-oxazolidinon, 2-oxazolidinetion, 3-buten-1-ilizotiocianát (BITC), fenilizotiocianát (PEITC), 1-izotiocianát-propilészter, izotiocianát-izopropil-észter és 2-fenilizotiocianát (2-PITC), amelyek közül 4 izotiocianát típus volt.

Számos tanulmány kimutatta, hogy az izotiocianátok megelőzhetik a különböző rákos megbetegedések kialakulását. A kutatások megállapították, hogy a PEITC dózisfüggően gátolja az egér K7M2 csontritkulásos sejtvonal proliferációját, és G2/M sejtciklus-megállást és apoptózist okozhat; a BITC jelentősen csökkenti a gyomor adenokarcinóma sejt AGS sejtjének életképességét, és apoptózist és autofágiát indukál. Az izotiocianátok méhnyakrákra gyakorolt hatásairól és mechanizmusairól azonban jelenleg kevés jelentés áll rendelkezésre. Ez a vizsgálat egy in vitro sejtmodell segítségével megállapította, hogy a BRIe jelentősen gátolta a Hela, Siha és U14 méhnyakráksejtek proliferációját idő- és dózisfüggő módon. E három sejttípus 24 órás IC50 értékeit összehasonlítva arra a következtetésre jutottunk, hogy a Hela sejtek a legérzékenyebbek a BRIe-re. A kontrollálatlan sejtproliferáció a rák alapvető oka, ami a sejtciklus megszakadásának köszönhető. Az áramlási citometriás elemzés kimutatta, hogy a BRIe képes megállítani a Hela sejtciklust az S és G2/M fázisban. A rákos sejtek áttétképzése mindig is a kutatás egyik forró pontja és a klinikai kezelés kihívása volt. Karcolásos kísérletekkel megállapították, hogy a BRIe hatékonyan gátolja a Hela sejtek migrációját. A Hochest 33258 festés kimutatta, hogy a BRIe képes DNS kondenzációt indukálni a Hela sejtmagokban, és látható szemcsés fluoreszcencia figyelhető meg a sejtmagokban, ami arra utal, hogy ez egy apoptotikus test. További elemzés Annexin V-FITC kettős festéssel kimutatta, hogy a BRIe-vel kezelt Hela sejtek apoptózisának aránya 24 óra elteltével a koncentráció növekedésével nőtt, ami azt jelzi, hogy a BRIe apoptózist indukál a Hela sejtekben. Összefoglalva, a BRIe jelentős méhnyakrákellenes aktivitást mutat. A GC-MS adatok alapján feltételezhető, hogy a BITC, a PEITC, az izopropil-izotiocianát és a 2-PITC lehetnek a fő hatóanyagai, amelyeket in vitro és in vivo kísérletekkel tovább kell validálni.

Összefoglalva, ez a tanulmány először határozta meg az izotiocianátok exogén enzimes hidrolízisének optimális előkészítési folyamatát a Chamagu-ban. Hét enzimatikus hidrolízishez kapcsolódó terméket azonosítottunk GC-MS analízis segítségével, és a BRIe enzimatikus hidrolízisből nyert termék képes gátolni a méhnyakráksejtek proliferációját, elnyomni a sejtmigrációt, sejtciklus-megállást és apoptózist indukálni. A kutatás referenciaalapot nyújt a chamagu növényi erőforrások további fejlesztéséhez és hasznosításához. A kutatási eredményeket a Natural Product Research and Development 2024. évi 6. számában tették közzé.