Purificación y actividad neuroprotectora de MIP-16, un péptido derivado de Morchella edulis
La enfermedad de Parkinson (EP) es la segunda enfermedad neurodegenerativa más importante en humanos, con una tasa de prevalencia de 2% a 3% entre individuos de 65 años o más. Las características patológicas de la EP pueden resumirse en la pérdida de un gran número de neuronas dopaminérgicas en la sustancia negra pars compacta, lo que provoca una disminución de la biosíntesis de dopamina en la sustancia negra y el cuerpo estriado. El mecanismo patogénico de la EP aún no está claro. Los estudios han confirmado que los factores ambientales, los factores genéticos, el estrés oxidativo y otros factores pueden estar implicados en la degeneración y muerte de las neuronas dopaminérgicas en la EP. Entre ellos, el estrés oxidativo es una causa importante de degeneración y muerte neuronal. Por un lado, el cerebro es el órgano con mayor consumo de oxígeno en las actividades fisiológicas normales de los seres humanos, pero la relativa falta de enzimas antioxidantes en el cerebro lo hace muy susceptible al daño por estrés oxidativo; Por otra parte, los primeros estudios han demostrado que un aumento del estrés oxidativo mitocondrial en las neuronas dopaminérgicas de la sustancia negra pars compacta puede desencadenar una cascada tóxica dependiente de la dopamina, que conduce a una disfunción lisosomal y a la acumulación de alfa sinucleína, que son las dos principales características patológicas de la enfermedad de Parkinson. En la actualidad, la terapia clásica de sustitución de dopamina se utiliza sobre todo en medicina para tratar la EP, como la suplementación de L-3,4-dihidroxifenilalanina (L-DOPA). Pero cada vez más estudios han descubierto que esta terapia clásica tiene importantes efectos secundarios. Las observaciones clínicas han descubierto que el tratamiento a largo plazo con L-DOPA tiene cierta probabilidad de provocar trastornos del movimiento en los pacientes con EP. Por lo tanto, empezar por reducir el estrés oxidativo y buscar nuevos agentes neuroprotectores es una de las posibles formas de prevenir y tratar la EP.
En los últimos años, la extracción y purificación de agentes neuroprotectores con actividad antioxidante a partir de productos naturales han recibido una amplia atención y se han logrado avances significativos. El salidrósido extraído de las raíces de Rhodiola rosea L., una planta de la familia Sedaceae, puede inhibir el estrés oxidativo y la inflamación para proteger las células PC12 apoptóticas. La paeoniflorina alivia la apoptosis inducida por 6-hidroxidopamina en células PC12 inhibiendo la activación de NF - κ B. Sin embargo, en comparación con las plantas, hay relativamente menos investigación sobre agentes neuroprotectores fúngicos. Algunos polisacáridos fúngicos pueden mostrar una buena actividad de eliminación de radicales libres y ejercer efectos neuroprotectores. Sin embargo, los polisacáridos fúngicos tienen un gran peso molecular, una estructura compleja y son difíciles de penetrar en la barrera hematoencefálica, lo que limita su aplicación como agentes neuroprotectores. Los extractos etanólicos o acuosos de ciertos hongos contienen factores neuroprotectores, pero la composición de los extractos aún no está clara y es necesario identificar la estructura de las sustancias funcionales.
Morchella spp. es un precioso hongo comestible y medicinal, que se registra en el Compendio de Materia Médica como "dulce y frío, no tóxico, que resuelve la flema y regula el qi, y beneficioso para el tracto gastrointestinal". Morchella importuna M. Kuo. es una variedad ampliamente cultivada en China. En nuestra investigación anterior, se confirmó que el extracto acuoso de Morchella importuna contiene una sustancia parecida al factor de crecimiento nervioso (NGF), que puede promover la diferenciación de las células PC12 y formar redes neuronales. Basándose en esto, este estudio purificó e identificó los componentes funcionales en el cuerpo fructífero de Morchella prolifera, construyó un modelo de célula PC12 dañada por 6-OHDA, verificó la actividad neuroprotectora de los componentes funcionales en el cuerpo fructífero de Morchella prolifera, proporcionó datos para el desarrollo de los beneficios para la salud de Morchella prolifera cultivada artificialmente, y proporcionó recursos alternativos para el cribado de agentes neuroprotectores derivados de hongos.

Algunos hongos de gran tamaño tienen un altísimo valor alimenticio y medicinal, y son ricos en proteínas, lo que los convierte en materias primas ideales para obtener péptidos naturales. Cordymin es un péptido extraído de Cordyceps sinensis, que puede inhibir la inflamación y aliviar el daño cerebral causado por la isquemia y la hipoxia en ratas. El péptido PEMP aislado del micelio de Pleurotus eryngii tiene funciones antioxidantes, antitumorales y de mejora inmunológica. En la actualidad, los principios activos de los hongos se centran principalmente en la investigación de los polisacáridos. En comparación con los polisacáridos fúngicos, los péptidos tienen una estructura simple, baja inmunogenicidad y son fáciles de sintetizar artificialmente, lo que los convierte en una parte muy prometedora del desarrollo de fármacos modernos. En la actualidad, para separar y purificar los polipéptidos de los hidrolizados de proteínas se suelen utilizar métodos cromatográficos en columna, como la cromatografía de intercambio iónico y/o la cromatografía de filtración en gel. Los primeros pueden separarse en función de la carga de los iones y las moléculas polares, mientras que los segundos pueden separarse en función del tamaño molecular. Sin embargo, en la actualidad no existen informes sobre métodos estándar para la extracción de péptidos fúngicos, y no se ha explorado el valor de pH del tampón de extracción ni si es necesaria la hidrólisis de la proteasa durante el proceso de extracción. Además, la extracción de péptidos de distintos tipos de hongos suele corresponder a métodos de extracción diferentes, lo que no favorece la promoción y aplicación de los péptidos fúngicos. En comparación con el método de extracción estándar para la maduración de polisacáridos fúngicos, es necesario explorar más a fondo el método de extracción de péptidos fúngicos. En este estudio, el MIP-16 se purificó utilizando una combinación de cromatografía de exclusión molecular y cromatografía líquida inversa de alto rendimiento. En primer lugar, el método dividió las moléculas en función de su tamaño y, a continuación, las subdividió en función de su polaridad. El experimento demostró que este método tiene una buena discriminabilidad, pero el tiempo experimental requerido es relativamente largo y se necesitan más mejoras.
La degeneración y la muerte celular de las neuronas dopaminérgicas del cuerpo estriado de la sustancia negra conducen a la deficiencia de dopamina, que es la causa principal de la enfermedad de Parkinson. Por lo tanto, la terapia de sustitución dopaminérgica (como la administración de suplementos de L-DOPA) es actualmente uno de los mejores métodos para tratar la enfermedad de Parkinson idiopática, que alivia los síntomas mediante la administración de suplementos de dopamina exógena. Sin embargo, tras el periodo inicial de respuesta óptima al tratamiento, el tratamiento a largo plazo con L-DOPA suele ir acompañado de efectos secundarios como la pérdida de la función motora. Además, los estudiosos han detectado 6-OHDA en la orina de pacientes con enfermedad de Parkinson que han estado tomando L-DOPA durante mucho tiempo. Por lo tanto, en este estudio, tratamos células PC12 con 6-OHDA para simular la aparición temprana de la EP y buscar nuevos agentes neuroprotectores. En nuestro estudio, encontramos que el tratamiento con 6-OHDA aumenta el nivel de ROS en las células PC12, lo que a su vez desencadena la apoptosis celular. Especulamos que el tratamiento a largo plazo con L-DOPA puede producir más 6-OHDA, lo que puede tener un efecto regulador de retroalimentación negativa en el tratamiento de la EP. Con base en el análisis anterior, a partir de la reducción de la presión oxidativa y la minimización del daño oxidativo, se espera buscar agentes neuroprotectores eficientes y seguros. Y los polisacáridos, péptidos, triterpenos y otros componentes contenidos en los hongos superiores tienen una buena actividad antioxidante. Por lo tanto, estamos buscando agentes neuroprotectores a partir de hongos para proporcionar recursos para el cribado de fármacos en la EP.
Las reacciones de oxidación pueden proporcionar energía para las actividades de la vida humana, pero los radicales anión superóxido y los radicales hidroxilo generados durante la reacción pueden causar daños oxidativos. La presencia de enzimas antioxidantes endógenas y otros antioxidantes tiende a equilibrar la producción y el consumo de ROS, manteniendo un estado estable en condiciones normales. Sin embargo, los estudios han descubierto que, a medida que aumenta la edad, la eficacia del sistema antioxidante disminuye gradualmente. En la población anciana, el aumento de especies reactivas del oxígeno supera la capacidad de eliminación del sistema antioxidante, lo que provoca estrés oxidativo y puede causar enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Parkinson. Las enzimas antioxidantes endógenas, incluyendo la superóxido dismutasa (SOD), catalasa (CAT), glutatión peroxidasa (GSH Px), etc., son el sistema de defensa natural del cuerpo contra el estrés oxidativo. Tras el tratamiento con 6-OHDA, la actividad de las enzimas antioxidantes intracelulares disminuyó significativamente. Se puede inferir que en este momento, el sistema de enzimas antioxidantes intracelulares excede significativamente la carga normal. El pretratamiento con MIP-16 durante 6 horas aumentó significativamente la actividad de las enzimas antioxidantes endógenas en las células PC12. Los niveles de SOD reflejan la carga del sistema enzimático antioxidante intracelular y reflejan indirectamente el nivel de radicales libres intracelulares. Este resultado puede indicar que la generación de superóxido aniónico se redujo tras el pretratamiento con MIP-16. Además, GSH Px es un componente central de la defensa antioxidante celular y un donante de electrones para ROS, lo que sugiere que MIP-16, como otro sistema de desintoxicación, puede afectar el metabolismo de GSH y evitar la muerte celular inducida por 6-OHDA.
Cuando el sistema enzimático antioxidante endógeno no puede eliminar a tiempo las ERO, éstas pueden dañar fácilmente las biomoléculas, lo que en última instancia conduce a la apoptosis celular. Bcl-2 y Bax son los genes inhibidores de la apoptosis y los genes promotores de la apoptosis más representativos de la familia de proteínas Bcl-2, respectivamente. La proteína Bax codificada por el gen Bax puede formar heterodímeros con Bcl-2, inhibiendo la expresión de Bcl-2. La investigación ha descubierto que la proporción de proteínas Bax/Bcl-2 es un factor clave que determina la fuerza de la inhibición de la apoptosis celular, y Bax/Bcl-2 también puede considerarse como un interruptor molecular para la apoptosis. El mecanismo de la apoptosis celular inducida por Bax es que Bax entra en la mitocondria bajo la acción de tBid, aumenta la permeabilidad de la membrana mitocondrial y, a continuación, libera citocromo C. La liberación de citocromo C es un paso clave en la vía endógena de la apoptosis celular, que se produce al dirigirse y activar la Caspasa-9, lo que conduce a la activación de las caspasas efectoras (como la Caspasa-3). Por lo tanto, este estudio investigó el efecto protector de MIP-16 en la apoptosis celular inducida por 6-OHDA mediante la detección de los niveles de expresión de Bcl-2 y Bax, así como la actividad de Caspasa (Caspasa-3 y Caspasa-9). A partir de nuestra investigación, observamos que el pretratamiento de 6-OHDA con MIP-16 aumentó significativamente los niveles de Bcl-2 y disminuyó los niveles de Bax, mientras que la inhibición de la actividad de la Caspasa-3 y Caspasa-9. Estos resultados sugieren que MIP-16 puede ejercer efectos antiapoptóticos mediante la regulación de la relación Bcl-2/Bax y la inhibición de la actividad de la Caspasa-3/-9.
Los resultados de la investigación indican que MIP-16 tiene un efecto inhibidor significativo sobre la apoptosis inducida por 6-OHDA en células PC12: remodelando la actividad de enzimas antioxidantes endógenas, incluyendo SOD, CAT, y GSH Px, como un promotor antioxidante endógeno. Reducir los niveles de ROS y la producción de MDA, disminuyendo así los niveles de oxidación celular e inhibiendo el inicio de la apoptosis. Regular la relación Bax/BCl-2, inhibiendo la expresión de Caspasa-9 y Caspasa-3, bloqueando así la vía de la apoptosis mitocondrial en las células. El MIP-16 tiene una estructura simple y es fácil de sintetizar artificialmente, por lo que se espera que se desarrolle y utilice como fármaco para aliviar y ayudar al tratamiento de la EP.