Lucky Grass'ın Etken Maddesi RCE-4'ün Serviks Kanserinde Ca Ski Hücrelerinin Proliferasyonunu, İnvazyonunu ve Migrasyonunu İnhibe Etmedeki Etkinliği ve Mekanizması Üzerine Çalışma
Serviks kanseri yaygın bir jinekolojik malign tümördür ve günümüzde klinik uygulamada cerrahi, radyoterapi ve kemoterapi başlıca tedavi yöntemleridir. Bununla birlikte, serviks kanserinin çoğunlukla kolay metastaz ve yayılma özelliklerine sahip invaziv bir tümör olması nedeniyle, genellikle kötü tedavi beklentilerine yol açmaktadır. Bu nedenle, invazyonunu ve göçünü engelleyebilecek yeni anti serviks kanseri kemoterapi ilaçlarının araştırılması çok dikkat çekmiştir. Doğal kaynaklı ilaçlar, çok hedefli, etkili ve düşük toksisite avantajları nedeniyle bilim insanları tarafından her zaman büyük değer görmüştür. RCE-4, laboratuvarımızda Liliaceae familyasından bir bitki olan Reineckia carnea (Andr.) Kunth'dan izole edilen bir spirostan saponindir. Kimyasal adı (1 β, 3 β, 5 β, 25S) - spirostan-1,3-diol1- [α - L-ramnoz - (1 → 2) - β - D-ksilopiranozittir. Yapı Şekil 1'de gösterilmiştir ve Reineckia carnea (Andr.) Kunth'un toplam saponinleri içinde en yüksek içeriğe (13%'ye kadar) sahiptir. Aynı zamanda farmakolojik aktivitesi de en iyisidir. RCE-4, Hubei Eyaleti'nin yerel Çin bitkisel ilaç standartlarına Reineckia carnea'nın önemli bir bileşeni olarak dahil edilmiştir.
Laboratuvarımızda yapılan önceki araştırmalar RCE-4'ün rahim ağzı kanseri Ca Ski hücrelerine karşı iyi bir seçici sitotoksisiteye sahip olduğunu ve çıplak fare Ca Ski hücre transplantasyonu tümörlerinin büyümesini önemli ölçüde engelleyebildiğini ortaya koymuştur. En yüksek tümör inhibisyon oranı 69.1%'ye ulaşabilir. Tedavi edilen farelerin uterus ve yumurtalıkları gibi önemli dokularında tümör hücresi metastazı, infiltrasyonu veya patolojik değişiklikler gözlenmemiştir. Önceki sonuçlardan ilham alarak, RCE-4'ün servikal kanser hücrelerinin invazyonu ve göçü üzerinde inhibe edici etkileri olabileceğini düşünüyoruz. Şu anda, ilgili aktiviteleri ve moleküler etki mekanizmaları hakkında herhangi bir rapor bulunmamaktadır.
Wnt/β - catenin ve Hippo/YAP, tümör invazyonu ve migrasyonu ile yakından ilişkili iki hücre içi sinyal yolağıdır. Her iki yolak da çekirdek sinyal molekülleri (β - catenin ve YAP/TAZ) aracılığıyla çekirdeğe girerek ve aşağı akış hedef genlerini transkribe etmek için transkripsiyon faktörleriyle bağlanarak tümör invazyonunu ve migrasyonunu düzenler. Wnt/β - catenin yolağının bloke edilmesi, tümör proliferasyonu üzerinde önemli bir inhibitör etkiye sahiptir. Wnt/β - catenin sinyal yolunun anormal aktivasyonu, büyüme ve gelişme kusurlarının yanı sıra tümörlerin ortaya çıkmasına, göç etmesine ve istilasına neden olabilir. Wnt/β - catenin yolağındaki MMP2 ve MMP9 gibi aşağı akış proteinlerinin aşağı regülasyonu tümör hücresi metastazını engelleyebilir. Wnt/β - catenin yolağının biyolojik işlevinin aksine, Hippo/YAP yolağı aktivasyonu hücre çoğalmasını engeller ve hücre apoptozunu teşvik eder. Hippo ile ilişkili aktive edici faktörlerin yokluğunda, fosforile olmayan YAP çekirdeğe aktarılır ve hedef genlerin ifadesini düzenlemek için transkripsiyon aktive edici faktör TEAD/TEF ailesi ile etkileşime girer. Hücre dışı stimülasyon sinyalleri Mst1/2'yi belirsiz bir mekanizma ile aktive edebilir ve ardından bir dizi kaskad fosforilasyon reaksiyonu yoluyla diğer çekirdek üyelerini fosforile edebilir.
Bu nedenle, bu çalışma servikal kanser Ca Ski hücrelerine odaklanacak ve RCE-4'ün Wnt/β - catenin ve Hippo/YAP sinyal yolakları aracılığıyla servikal kanser proliferasyonu, invazyonu ve migrasyonu üzerindeki etkilerini ve moleküler mekanizmalarını araştıracak ve RCE-4'ün gelecekteki klinik uygulamaları için teorik destek sağlayacaktır.

Laboratuvarımız MTT deneyleri ile RCE-4'ün Ca Ski hücrelerinin çoğalmasını zamana ve doza bağlı bir şekilde engelleyebildiğini göstermiştir. Bu çalışmadaki klon oluşumu deneyinin sonuçları RCE-4'ün etkinliğini daha da doğrulamaktadır. Ayrıca, RCE-4'ün Ca Ski hücrelerinin invazyonu ve göçü üzerindeki etkisi çizik deneyleri ve Transwell odası in vitro invazyon deneyleri ile tespit edilmiştir. Sonuçlar, RCE-4'ün Ca Ski hücrelerinin göç ve istila kabiliyetini önemli ölçüde engellediğini ve konsantrasyon bağımlılığı sergilediğini göstermiştir.
Wnt/β - catenin sinyal yolu tümör migrasyonunda önemli bir rol oynamaktadır ve β - catenin'in çekirdeğe girişi bu yolun aktivasyonunun anahtarıdır. Sonuçlar, RCE-4'ün β - catenin'in nükleer girişini üç yolla inhibe edebileceğini göstermiştir: p-GSK3 β ekspresyonunu inhibe etmek, β - catenin'in fosforilasyonunu teşvik etmek ve PAK4 ekspresyonunu inhibe etmek, böylece matris metaloproteinazlar MMP2/7/9/14 gibi aşağı akış genlerinin transkripsiyonunu inhibe etmek. İlginç bir şekilde, son araştırmalar PAK4 aktivitesinin inhibe edilmesinin PD-1 immün blokaj tedavisinin terapötik etkisini sinerjik olarak artırabileceğini bulmuştur. PD-1 tedavisinin, tümör dokusunda bağışıklık hücrelerinin önceden infiltrasyonu olmadığında çok az etkinliği vardır ve bu da PD-1 tedavisine direnç gelişmesinin ana nedenidir. PAK4 inhibitörlerinin kullanımı, tümör dokularının in vivo PD-1 blokaj tedavisine yanıtını önemli ölçüde artırabilir. RCE-4'ün PAK4 üzerindeki önemli inhibitör etkisi göz önüne alındığında, bu bize yeni bir araştırma yönü sağlamaktadır.
Hippo/YAP sinyal yolu ile tümör hücresi istilası arasındaki ilişki de doğrulanmıştır, ancak şu ana kadar Hippo/YAP sinyal yolunu hedef alan nispeten az sayıda ilaç bulunmaktadır. 2018 yılında Gill ve arkadaşları, YAP/TAZ moleküllerinin çekirdeğe girişi etrafında beş protein molekülünden oluşan özel bir pozitif geri besleme döngüsü olduğunu bulmuştur: NUAK2, LATS1, p-LATS1, sitoplazma ve çekirdekte YAP/TAZ. NUAK2, fosforilasyonunu önlemek için LATS1'in ekspresyonunu inhibe edebilir, böylece YAP/TAZ kompleks moleküllerinin sitoplazmadan çekirdeğe transferini teşvik eder. Çekirdeğe giren YAP/TAZ molekülleri NUAK2 transkriptlerine bağlanır ve transkripsiyonu yapılan NUAK2 sitoplazmaya girerek pozitif bir geri besleme döngüsü oluşturur. Bu döngünün keşfi Hippo/YAP sinyal yolunu daha karmaşık hale getirmekte ve tümör hücresi istilasını engellemek için Hippo/YAP sinyal yolunun düzenlenmesinin zorluğunu açıklamaktadır. Bu deneyin sonuçları, RCE-4'ün YAP/TAZ'ın nükleer girişini, MST1'in fosforilasyonunu inhibe etmek, YAP'ın fosforilasyonunu arttırmak ve YAP'ın ekspresyonunu azaltmak dahil olmak üzere çoklu yollarla inhibe edebileceğini göstermiştir. Çekirdekte YAP/TAZ'ın azalması NUAK2'nin ekspresyonunda azalmaya yol açarak bu pozitif geri besleme döngüsünü kırar. Döngünün bozulması, hücreler arası adezyon molekülü-1 (ICAM-1), vasküler hücre adezyon molekülü-1 (VCAM-1), CYR61 ve SOX2 gibi aşağı akış proteinlerinin ekspresyonunda bir azalmaya yol açarak Ca Ski hücrelerinin göç yeteneğini önemli ölçüde engeller.
Hücrelerdeki Wnt/β - catenin ve Hippo/YAP sinyal yollarının tamamen ilgisiz olmadığını ve birçok şekilde etkileşime girdiklerini belirtmek gerekir. Örneğin, fosforile YAP/TAZ β - catenin'e bağlanarak sitoplazmada kalmasına ve transkripsiyonel aktivitesini inhibe etmesine neden olabilir. YAP, GSK3 β'nın inaktivasyonunu indükleyebilir, bu da sitoplazmik β - catenin'i stabilize eder ve β - catenin'in nükleer transferini teşvik eder. Bu çalışma henüz iki sinyal yolunun karşılıklı geri bildirim düzenlemesi üzerine derinlemesine bir araştırma yapmamıştır. Aynı zamanda, araştırmanın bu aşamasının da belirli sınırlamaları vardır. Hela ve SiHa gibi diğer servikal kanser hücre hatları için doğrulanmamıştır ve hayvan deneysel sonuçlarından yoksundur. Bu aynı zamanda bizim bir sonraki araştırma yönümüzdür.
Özetle, RCE-4, Ca Ski hücrelerinin istilasını ve göçünü engelleme konusunda iyi bir yeteneğe sahiptir. Moleküler mekanizması temel olarak β - catenin ve YAP/TAZ'ın çekirdeğe girmesinin kilit adımını bloke ederek, böylece Wnt/β - catenin sinyal yolunun aktivasyonunu inhibe ederek ve Hip po/YAP sinyal yolunu aktive ederek elde edilir.