Undersøgelse af aktiviteten og mekanismen af RCE-4, en aktiv ingrediens i Lucky Grass, i forbindelse med hæmning af spredning, invasion og migration af Ca Ski Cells i livmoderhalskræft
Livmoderhalskræft er en almindelig gynækologisk ondartet tumor, og i øjeblikket er kirurgi, strålebehandling og kemoterapi de vigtigste behandlinger for den i klinisk praksis. Men da livmoderhalskræft for det meste er en invasiv tumor med karakter af let metastase og spredning, fører det ofte til dårlige behandlingsforventninger. Derfor har søgningen efter nye kemoterapeutiske lægemidler mod livmoderhalskræft, der kan hæmme dens invasion og migration, tiltrukket sig stor opmærksomhed. Lægemidler fra naturlige kilder har altid været højt værdsat af forskere på grund af deres fordele med flere mål, effektivitet og lav toksicitet. RCE-4 er et spirostan-saponin isoleret fra Reineckia carnea (Andr.) Kunth, en plante af Liliaceae-familien, i vores laboratorium. Dets kemiske navn er (1 β, 3 β, 5 β, 25S) - spirostan-1,3-diol1- [α - L-rhamnose - (1 → 2) - β - D-xylopyranosid. Strukturen er vist i figur 1, og den har det højeste indhold (op til 13%) i de samlede saponiner fra Reineckia carnea (Andr.) Kunth. Samtidig er dets farmakologiske aktivitet også den bedste. RCE-4 er blevet inkluderet som en vigtig komponent i Reineckia carnea i de lokale standarder for kinesisk urtemedicin i Hubei-provinsen.
Tidligere forskning i vores laboratorium har vist, at RCE-4 har en god selektiv cytotoksicitet mod livmoderhalskræft Ca Ski-celler og kan hæmme væksten af Ca Ski-celletransplantationstumorer hos nøgne mus betydeligt. Den højeste tumorinhiberingshastighed kan nå 69,1%. Der blev ikke observeret tumorcellemetastaser, infiltration eller patologiske ændringer i vigtige væv som livmoderen og æggestokkene hos de behandlede mus. Med inspiration fra tidligere resultater spekulerer vi i, at RCE-4 kan have en hæmmende effekt på invasionen og migrationen af livmoderhalskræftceller. I øjeblikket har der ikke været nogen rapporter om dets relaterede aktiviteter og molekylære virkningsmekanismer.
Wnt/β - catenin og Hippo/YAP er to intracellulære signalveje, der er tæt forbundet med tumorinvasion og -migration. Begge veje regulerer tumorinvasion og -migration ved at komme ind i kernen gennem deres centrale signalmolekyler (β-catenin og YAP/TAZ) og binde sig til transkriptionsfaktorer for at transkribere downstream-målgener. Blokering af Wnt/β - catenin-stien har en betydelig hæmmende effekt på tumorproliferation. Unormal aktivering af Wnt/β - catenin-signalvejen kan forårsage vækst- og udviklingsdefekter samt forekomst, migration og invasion af tumorer. Nedregulering af downstream-proteiner som MMP2 og MMP9 i Wnt/β - catenin-signalvejen kan hæmme metastase af tumorceller. I modsætning til den biologiske funktion af Wnt/β - catenin-vejen hæmmer aktivering af Hippo/YAP-vejen celleproliferation og fremmer celleapoptose. I fravær af Hippo-relaterede aktiverende faktorer overføres ikke-phosphoryleret YAP til kernen og interagerer med den transkriptionsaktiverende faktor TEAD/TEF-familien for at regulere udtrykket af målgener. Ekstracellulære stimuleringssignaler kan aktivere Mst1/2 gennem en uklar mekanisme og derefter fosforylere andre kernemedlemmer gennem en række kaskadefosforyleringsreaktioner.
Derfor vil denne undersøgelse fokusere på livmoderhalskræft Ca Ski-celler og undersøge virkningerne og de molekylære mekanismer af RCE-4 på spredning, invasion og migration af livmoderhalskræft gennem Wnt/β - catenin og Hippo/YAP-signalvejene, hvilket giver teoretisk støtte til den fremtidige kliniske anvendelse af RCE-4.

Vores laboratorium har vist gennem MTT-eksperimenter, at RCE-4 kan hæmme spredningen af Ca Ski-celler på en tidsafhængig og dosisafhængig måde. Resultaterne af klondannelsesforsøget i denne undersøgelse validerer yderligere effektiviteten af RCE-4. Derudover blev effekten af RCE-4 på invasionen og migrationen af Ca Ski-celler påvist gennem scratch-eksperimenter og in vitro-invasionseksperimenter i Transwell-kammeret. Resultaterne viste, at RCE-4 signifikant hæmmede Ca Ski-cellers migrations- og invasionsevne og udviste koncentrationsafhængighed.
Wnt/β - catenin-signalvejen spiller en vigtig rolle i tumormigration, og indtræden af β - catenin i kernen er nøglen til aktivering af denne vej. Resultaterne viste, at RCE-4 kan hæmme den nukleare indtrængen af β-catenin gennem tre veje: hæmning af udtrykket af p-GSK3 β, fremme af fosforyleringen af β-catenin og hæmning af udtrykket af PAK4, hvorved transkriptionen af downstream-gener som matrixmetalloproteinaser MMP2/7/9/14 hæmmes. Interessant nok har den seneste forskning vist, at hæmning af PAK4's aktivitet synergistisk kan forbedre den terapeutiske effekt af PD-1-immunblokadebehandling. PD-1-terapi har ringe effekt i fravær af præinfiltration af immunceller i tumorvæv, hvilket også er hovedårsagen til udviklingen af resistens over for PD-1-terapi. Brugen af PAK4-hæmmere kan forbedre tumorvævets respons på PD-1-blokadebehandling in vivo betydeligt. I betragtning af den betydelige hæmmende effekt af RCE-4 på PAK4 giver dette os en ny forskningsretning.
Forholdet mellem Hippo/YAP-signalvejen og tumorcelleinvasion er også blevet bekræftet, men indtil videre er der relativt få lægemidler rettet mod Hippo/YAP-signalvejen. I 2018 fandt Gill et al. ud af, at der er en særlig positiv feedback-loop omkring YAP/TAZ-molekylernes indtræden i kernen, som består af fem proteinmolekyler: NUAK2, LATS1, p-LATS1, YAP/TAZ i cytoplasmaet og kernen. NUAK2 kan hæmme udtrykket af LATS1 for at forhindre dets fosforylering og derved fremme overførslen af YAP/TAZ-kompleksmolekyler fra cytoplasmaet til kernen. YAP/TAZ-molekyler, der kommer ind i kernen, binder sig til NUAK2-transkripter, og det transkriberede NUAK2 kommer ind i cytoplasmaet og danner et positivt feedback-loop. Opdagelsen af denne cyklus gør Hippo/YAP-signalvejen mere kompleks og forklarer vanskeligheden ved at regulere Hippo/YAP-signalvejen for at hæmme invasionen af tumorceller. Resultaterne af dette eksperiment viste, at RCE-4 kan hæmme YAP/TAZ's nukleare indtrængen gennem flere veje, herunder hæmning af fosforyleringen af MST1, forbedring af fosforyleringen af YAP og reduktion af udtrykket af YAP. Reduktionen af YAP/TAZ i kernen fører til et fald i udtrykket af NUAK2 og bryder dermed denne positive feedback-loop. Afbrydelsen af cyklussen fører til et fald i udtrykket af downstream-proteiner som intercellulært adhæsionsmolekyle-1 (ICAM-1), vaskulært celleadhæsionsmolekyle-1 (VCAM-1), CYR61 og SOX2, hvilket hæmmer Ca Ski-cellernes migrationsevne betydeligt.
Det er værd at bemærke, at Wnt/β - catenin- og Hippo/YAP-signalvejene i cellerne ikke er helt uafhængige af hinanden, og at de interagerer på mange måder. For eksempel kan fosforyleret YAP/TAZ binde sig til β-catenin, hvilket får det til at forblive i cytoplasmaet og hæmmer dets transkriptionelle aktivitet. YAP kan inducere inaktivering af GSK3 β, som igen stabiliserer cytoplasmatisk β - catenin og fremmer nuklear overførsel af β - catenin. Denne undersøgelse har endnu ikke udført dybdegående forskning i den gensidige feedback-regulering af de to signalveje. Samtidig har dette forskningsstadie også visse begrænsninger. Det er ikke blevet valideret for andre cellelinjer af livmoderhalskræft som Hela og SiHa, og der mangler resultater fra dyreforsøg. Dette er også vores næste forskningsretning.
Sammenfattende har RCE-4 en god evne til at hæmme invasionen og migrationen af Ca Ski-celler. Dens molekylære mekanisme opnås hovedsageligt ved at blokere nøgletrinnet for β - catenin og YAP/TAZ, der kommer ind i kernen, og derved hæmme aktiveringen af Wnt/β - catenin-signalvejen og aktivere Hip po/YAP-signalvejen.