Az RCE-4, a Lucky Grass aktív összetevőjének aktivitásának és mechanizmusának vizsgálata a Ca Ski sejtek proliferációjának, inváziójának és migrációjának gátlásában a méhnyakrák esetében
A méhnyakrák gyakori nőgyógyászati rosszindulatú daganat, és jelenleg a klinikai gyakorlatban a műtét, a sugárkezelés és a kemoterápia a fő kezelési módok. Mivel azonban a méhnyakrák többnyire invazív daganat, amelynek jellemzői a könnyű áttétképződés és terjedés, gyakran rossz kezelési elvárásokhoz vezet. Ezért nagy figyelmet kapott az új méhnyakrák elleni kemoterápiás gyógyszerek keresése, amelyek képesek gátolni az inváziót és a migrációt. A természetes forrásból származó gyógyszereket a tudósok mindig is nagyra értékelték többcélú, hatékony és alacsony toxicitású előnyeik miatt. Az RCE-4 egy spirosztán szaponin, amelyet a Reineckia carnea (Andr.) Kunth-ból, a Liliaceae családba tartozó növényből izoláltunk laboratóriumunkban. Kémiai neve (1 β, 3 β, 5 β, 25S) - spirosztán-1,3-diol1- [α - L-ramnóz - (1 → 2) - β - D-xilopiranozid. Szerkezete az 1. ábrán látható, és a Reineckia carnea (Andr.) Kunth összes szaponinjában ez a legmagasabb (akár 13%). Ugyanakkor farmakológiai aktivitása is a legjobb. Az RCE-4 a Reineckia carnea egyik mérföldkőnek számító összetevőjeként szerepel Hubei tartomány helyi kínai gyógynövénygyógyászati szabványaiban.
Laboratóriumunk korábbi kutatásai azt találták, hogy az RCE-4 jó szelektív citotoxicitással rendelkezik a méhnyakrák Ca Ski sejtjeivel szemben, és jelentősen gátolja a meztelen egér Ca Ski sejtek transzplantációs daganatainak növekedését. A legmagasabb tumor gátlási arány elérheti a 69,1%. A kezelt egerek fontos szöveteiben, például a méhben és a petefészekben nem észleltek tumorsejt-metasztázisokat, infiltrációt vagy patológiai elváltozásokat. A korábbi eredményekből kiindulva feltételezzük, hogy az RCE-4 gátló hatással lehet a méhnyakráksejtek inváziójára és migrációjára. Jelenleg még nem számoltak be az ezzel kapcsolatos tevékenységéről és molekuláris hatásmechanizmusairól.
A Wnt/β-katenin és a Hippo/YAP két intracelluláris jelátviteli útvonal, amelyek szorosan kapcsolódnak a tumorinvázióhoz és a migrációhoz. Mindkét útvonal úgy szabályozza a tumorinváziót és -migrációt, hogy központi jelátviteli molekuláikon (β - catenin és YAP/TAZ) keresztül belépnek a sejtmagba, és a transzkripciós faktorokhoz kötődve átírják a downstream célgéneket. A Wnt/β - katenin útvonal blokkolása jelentős gátló hatással van a tumorproliferációra. A Wnt/β - katenin jelátviteli útvonal rendellenes aktivációja növekedési és fejlődési rendellenességeket, valamint a daganatok kialakulását, migrációját és invázióját okozhatja. A Wnt/β - katenin útvonalban a downstream fehérjék, például az MMP2 és az MMP9 downregulációja gátolhatja a tumorsejtek metasztázisát. A Wnt/β - katenin útvonal biológiai funkciójával ellentétben a Hippo/YAP útvonal aktiválása gátolja a sejtproliferációt és elősegíti a sejtek apoptózisát. A Hippo-hoz kapcsolódó aktiváló faktorok hiányában a nem foszforilált YAP a sejtmagba kerül, és a TEAD/TEF család transzkripciót aktiváló faktorával kölcsönhatásba lépve szabályozza a célgének expresszióját. Az extracelluláris stimulációs jelek egy tisztázatlan mechanizmuson keresztül aktiválhatják az Mst1/2-t, majd egy sor kaszkád foszforilációs reakción keresztül foszforilálják a többi magtagot.
Ezért ez a tanulmány a méhnyakrák Ca Ski sejtekre összpontosít, és megvizsgálja az RCE-4 hatását és molekuláris mechanizmusait a méhnyakrák proliferációjára, inváziójára és migrációjára a Wnt/β-katenin és Hippo/YAP jelátviteli utakon keresztül, elméleti támogatást nyújtva az RCE-4 jövőbeli klinikai alkalmazásához.

Laboratóriumunk MTT-kísérletekkel kimutatta, hogy az RCE-4 idő- és dózisfüggő módon képes gátolni a Ca Ski sejtek proliferációját. A jelen tanulmányban végzett klónképzési kísérlet eredményei tovább validálják az RCE-4 hatékonyságát. Ezenkívül az RCE-4 hatását a Ca Ski sejtek inváziójára és migrációjára karcolásos kísérletekkel és Transwell-kamrás in vitro inváziós kísérletekkel mutattuk ki. Az eredmények azt mutatták, hogy az RCE-4 jelentősen gátolta a Ca Ski sejtek migrációs és inváziós képességét, és koncentrációfüggést mutatott.
A Wnt/β-katenin jelátviteli útvonal fontos szerepet játszik a tumormigrációban, és a β-katenin bejutása a sejtmagba a kulcs az útvonal aktiválásához. Az eredmények azt mutatták, hogy az RCE-4 három útvonalon keresztül képes gátolni a β - katenin nukleáris bejutását: gátolja a p-GSK3 β expresszióját, elősegíti a β - katenin foszforilációját, és gátolja a PAK4 expresszióját, ezáltal gátolja a downstream gének, például az MMP2/7/9/14 mátrix metalloproteinázok transzkripcióját. Érdekes módon a legújabb kutatások szerint a PAK4 aktivitásának gátlása szinergikusan fokozhatja a PD-1 immunblokkoló terápia terápiás hatását. A PD-1 terápia kevéssé hatásos, ha a tumorszövetben nincs előzetes immunsejt-infiltráció, ami egyben a PD-1 terápiával szembeni rezisztencia kialakulásának fő oka is. A PAK4-gátlók alkalmazása jelentősen fokozhatja a tumorszövetek PD-1-blokád terápiára adott válaszát in vivo. Figyelembe véve az RCE-4 jelentős gátló hatását a PAK4-re, ez új kutatási irányt ad számunkra.
A Hippo/YAP jelátviteli útvonal és a tumorsejtek inváziója közötti kapcsolatot szintén megerősítették, de eddig viszonylag kevés olyan gyógyszer létezik, amely a Hippo/YAP jelátviteli útvonalat célozza. 2018-ban Gill és munkatársai megállapították, hogy a YAP/TAZ molekulák sejtmagba való bejutása körül egy speciális pozitív visszacsatolási hurok van, amely öt fehérjemolekulából áll: NUAK2, LATS1, p-LATS1, YAP/TAZ a citoplazmában és a sejtmagban. A NUAK2 képes gátolni a LATS1 expresszióját, hogy megakadályozza annak foszforilációját, ezáltal elősegítve a YAP/TAZ komplex molekulák citoplazmából a sejtmagba való átjutását. A magba kerülő YAP/TAZ molekulák a NUAK2 transzkriptumokhoz kötődnek, és az átírt NUAK2 a citoplazmába kerül, pozitív visszacsatolási hurkot alkotva. E ciklus felfedezése összetettebbé teszi a Hippo/YAP jelátviteli útvonalat, és megmagyarázza a Hippo/YAP jelátviteli útvonal szabályozásának nehézségét a tumorsejtek inváziójának gátlása érdekében. A kísérlet eredményei azt mutatták, hogy az RCE-4 több útvonalon keresztül képes gátolni a YAP/TAZ nukleáris belépését, beleértve az MST1 foszforilációjának gátlását, a YAP foszforilációjának fokozását és a YAP expressziójának csökkentését. A YAP/TAZ sejtmagba való bejutásának csökkenése a NUAK2 expressziójának csökkenéséhez vezet, így megszakítva ezt a pozitív visszacsatolási hurkot. A ciklus megszakadása a downstream fehérjék, például az intercelluláris adhéziós molekula-1 (ICAM-1), a vaszkuláris sejtadhéziós molekula-1 (VCAM-1), a CYR61 és a SOX2 expressziójának csökkenéséhez vezet, jelentősen gátolva a Ca Ski sejtek migrációs képességét.
Érdemes megjegyezni, hogy a Wnt/β-katenin és a Hippo/YAP jelátviteli útvonalak a sejtekben nem teljesen függetlenek egymástól, és számos módon kölcsönhatásba lépnek egymással. Például a foszforilált YAP/TAZ kötődhet a β - kateninhez, aminek következtében az a citoplazmában marad, és gátolja annak transzkripciós aktivitását. A YAP a GSK3 β inaktiválását indukálhatja, ami viszont stabilizálja a citoplazmatikus β - katenint és elősegíti a β - katenin nukleáris transzportját. Ez a tanulmány még nem végzett mélyreható kutatást a két jelátviteli útvonal kölcsönös visszacsatolásos szabályozásáról. Ugyanakkor a kutatás ezen szakaszának vannak bizonyos korlátai is. Nem validálták más méhnyakrákos sejtvonalakra, például a Hela és a SiHa esetében, és hiányoznak az állatkísérleti eredmények. Ez a következő kutatási irányunk is.
Összefoglalva, az RCE-4 jól gátolja a Ca Ski sejtek invázióját és migrációját. Molekuláris mechanizmusa elsősorban a β-katenin és a YAP/TAZ sejtmagba való bejutásának kulcsfontosságú lépésének blokkolásával érhető el, ezáltal gátolva a Wnt/β-katenin jelátviteli útvonal aktiválódását és aktiválva a Hip po/YAP jelátviteli útvonalat.