Qianghuo tohumlarının farklı uyku durumlarındaki endofitik bakteri topluluklarının bileşiminin ve farklılıklarının analizi
Notopterygium incisum Ting ex H. T. Chang, Umbelliferae familyasında yer alan bir bitki türüdür. Kurutulmuş rizomları ilaç olarak kullanılır ve genellikle kara ilaç olarak bilinen geleneksel Çin ve Tibet tıbbında yaygın olarak kullanılır. Yüksek bir pazar talebine sahiptir. Şu anda, Qianghuo esas olarak yabani kaynaklardan gelmektedir ve çoğunlukla Sichuan, Gansu, Qinghai ve diğer yerlerde 3000-4500m yükseklikteki çalılık otlak alanlarda dağılmıştır. Son yıllarda, aşırı kazı ekolojik çevreye büyük zarar vermiştir ve yabani Qiang canlı kaynakları tükenmeye yaklaşmaktadır. Bu nedenle acilen yapay evcilleştirme ve yetiştiriciliğe ihtiyaç duyulmaktadır.
Qianghuo tohumları olgunlaştığında ve karaya çıktığında, embriyo gelişimi tamamlanmamıştır ve genellikle embriyo veya ilkel embriyo fenomeni yoktur. Morfoloji ve fizyoloji açısından ikili bir dormansi özelliğine sahiptir ve derin dormansi tohumlarına aittir. Qianghuo tohumlarının doğal ortamlardaki çimlenme oranı son derece düşüktür (0.52%). Qianghuo tohumlarının dormansisini gidermek için mevcut etkili yöntem GA+değişken sıcaklıkta kum depolama yöntemidir. İlk olarak, morfolojik dormansilerini gidermek için ılık sıcaklıkta kum depolama yöntemi kullanılır ve ardından tohumlar çimlenme kabiliyetine sahip olmadan önce fizyolojik dormansilerini gidermek için düşük sıcaklıkta kum depolama işlemi gerekir. Tohum işleme süresi 8 aydan fazla sürebilir. Qianghuo tohumlarını işlemek için bu yöntem kullanıldığında, en yüksek çimlenme oranı 21.2%'dir. Buna ek olarak, Qianghuo şifalı bitkilerinin büyüme döngüsü 4 yıldan fazladır ve uzun yatırım döngüsü ve yavaş etkinlik nedeniyle, yapay yetiştiriciliğin gelişimi çok yavaştır. Şu anda, Qianghuo pazarının sürdürülebilir kalkınma ihtiyaçlarını karşılayamayan sadece düzensiz yetiştirme mevcuttur. Qianghuo tohumlarının dormansisini manuel olarak serbest bırakma teknolojisi son on yılda çığır açan bir ilerleme kaydetmemiştir ve bu da Qianghuo'nun büyük ölçekli ekimini kısıtlayan ana sorunlardan biridir.
Bitkilerdeki endofitik bakteriler, yaşam döngülerinin belirli veya tüm aşamalarında sağlıklı bitkilerin çeşitli doku ve organlarında yaşayan mantar veya bakterileri ifade eder. Uzun süreli birliktelikte konukçu bitki ile karmaşık ve özel bir mutualistik ilişki oluştururlar ve bitkide oksin ve mitojen metabolizmasını artırarak hücre bölünmesini, kök gelişimini ve fide büyümesini desteklerler. Tohumların dormansisi gibberellin büyüme destekleyicileri ve absisik asit büyüme inhibitörleri arasındaki denge ile kontrol edilir. Araştırmalar, endofitik bakterilerin bitkilerde endojen hormonların sentezini düzenleyerek veya indükleyerek tohum dormansisini düzenleyebildiğini ve tohumlarda büyümeyi teşvik edici işlevlere sahip endofitik bakteri kaynaklarının araştırılması için teorik bir temel sağladığını ortaya koymuştur. Pu Fengya ve arkadaşları, Job's tears'daki endofitik bakterilerin Job's tears, pirinç ve buğday tohumlarının çimlenme oranını artırabildiğini ve kök büyümesini teşvik ederek fide büyümesini desteklediğini bulmuşlardır. Lei Ruifeng, gümüş kum çekirgesi tohumlarındaki endofitik bakterilerin tohum metabolizmasını düzenleyerek tohum çimlenmesini teşvik ettiğini keşfetti. Xiang Yiqing ve diğerleri, Huanglian tohumlarındaki endofitik bakterilerin Huanglian tohumlarının çimlenme oranını önemli ölçüde artırabileceğini bulmuştur. Sichuan biberi (Capsicum annuum), pirinç (Oryza sativa L.) ve Dendrobium catenatum'un endofitik bakterileri, oksin, absisik asit, sitokinin, gibberellik asit gibi endojen hormonları salgılayarak konukçu bitkilerin büyümesini ve gelişmesini doğrudan teşvik eder. Achnatherum inebrians, Dendrobium nobile ve Lolium rigidum tohumlarından izole edilen endofitik bakterilerin yanı sıra Polygonatum multiflorum L. köklerinden izole edilen endofitik bakteriler, sitokinin gibi endojen hormonlar salgılayarak tohum dormansisini düzenler, çimlenme ve hayatta kalma oranlarını önemli ölçüde artırır. Bununla birlikte, Qianghuo tohumlarındaki endofitik bakteriler, embriyosunun büyümesini teşvik ederek dormansinin serbest kalmasını sağlayabilir mi? Buna dayanarak, bu deney Qianghuo tohumlarını araştırma nesnesi olarak alır ve Qianghuo tohumlarının farklı dormansi durumlarındaki endofitik bakteri topluluklarının bileşimini ve farklılıklarını incelemek için Illumina MiSeq kültürsüz yüksek verimli dizileme teknolojisini kullanır. Bu, Qianghuo tohumunun uyku halini gidermek için mikroorganizmaların kullanımına ilişkin daha fazla araştırma için teorik bir temel sağlar ve aynı zamanda benzer uyku hali özelliklerine sahip bitkilerin yetiştirilmesi için önemli teorik referanslar sağlar.

Bitkilerin önemli bir üreme organı olan tohumlar, faydalı mikroorganizmaların dikey yayılma yoluyla ana bitkilerden bir sonraki nesle aktarılması için bir ortam görevi görebilir ve böylece tohum çimlenmesini ve fide büyümesini teşvik edebilir. Pirinç ve mısır gibi otların tohumlarındaki endofitik bakteriler tohum çimlenmesi, fide büyümesi ve gelişimi ile konak bitki büyümesinde önemli bir rol oynar. Dendrobium nobile Lindl. tohumları olgunlaşmadan sonra ortaya çıkar ve endosperm dokusundan yoksundur, çimlenme için mikroorganizmalarla simbiyoz gerektirir. Baskın endofitik bakteriler çoğunlukla Proteobacteria ve Cyanobacteria'dır. Bu çalışma, Qianghuo tohumlarının üç farklı uyku durumunda olduğunu ve endofitik bakteri topluluklarının türlerinin filum düzeyinde benzer olduğunu bulmuştur. Endofitik bakteriler temel olarak Proteobacteria, Actinobacteria ve Firmicutes'ten oluşmaktadır ve bu da diğer bitki tohumlarının baskın endofitik bakteri filumlarıyla tutarlıdır. Bununla birlikte, Dendrobium officinale tohumları ile karşılaştırıldığında, baskın endofitik bakteri filumu farklılıklar göstermektedir. Bitki salgılarının türleri ve mikroorganizmaların kolonize olma, hayatta kalma ve tohumlara yayılma kabiliyetleri farklılık gösterir, bu da farklı bitki tohumlarındaki endofitik bakterilerde farklılıklara neden olur. Tohumlardaki endofitik bakteriler farklı bitki organlarından veya meristematik dokulardan geldiği için, mikrotübül bağlantıları veya gametler yoluyla tohum embriyosuna ve endosperme aktarılır ve kolonize olur ve dikey olarak yayılırlar. Tıbbi bitkiler Qianghuo ve Dendrobium officinale tohumlarının her ikisi de dormansi özellikleri nedeniyle çimlenmekte zorluk çekmektedir. Bununla birlikte, çalışmalar her ikisinin de baskın endofitik bakteri filumunun farklılıklar gösterdiğini ve bunun da farklı endofitik bakteri kaynaklarından kaynaklanabileceğini ortaya koymuştur. Qianghuo tohumları tamamlanmamış embriyo gelişimi nedeniyle dormanttır ve endofitik bakterileri esas olarak endospermden gelirken, Dendrobium officinale tohumları endosperm eksikliği nedeniyle dormanttır. Endofitik bakterileri esas olarak embriyodan gelir, bu nedenle ikisi arasında filum türlerinde farklılıklar vardır. Qianghuo tohumlarının da çimlenmek için mikroorganizmalarla bir arada bulunması gerektiği tahmin edilmektedir. GSC durumundaki Qianghuo tohumlarında Bacteroidetes filumuna ait az miktarda endofitik bakteri (2.01%) ortaya çıkarken, Bacteroidetes filumuna ait bilinmeyen endofitik mantarlar GSB ve GSC durumlarındaki tohumların sırasıyla 24.33% ve 7.74%'sinde ortaya çıkmıştır. Bu endofitik bakteriler tohum embriyosunun büyümesini teşvik etmede ve tohum dormansisini gidermede önemli bir rol oynayabilir ve gelecekteki araştırmaların odak noktası olacaktır. Endofitik mantarlar birçok bitkinin tohumlarında yüksek bolluk ve çeşitliliğe sahiptir. Qianghuo tohumlarındaki endofitik mantarlar esas olarak Ascomycota ve Basidiomycota'dan oluşmaktadır; bu da Phaseolus vulgaris L. tohumları ve Dendrobium nobile tohumlarındaki baskın endofitik mantarlarla tutarlıdır.

Cins düzeyinde, endofitik bakteri topluluklarının bileşimi GSA'dan GSB durumuna değişmektedir ve endofitik bakteri topluluklarının türleri GSB'den GSC'ye benzerdir. Alfa çeşitlilik analizi ile, GSA'daki endofitik bakteri çeşitliliğinin GSB ve GSC'dekinden önemli ölçüde daha düşük olduğu, GSB ve GSC arasında ise endofitik bakteri çeşitliliğinde önemli bir fark olmadığı bulunmuştur. Bunun ana nedeni, GSA durumunda Proteobacteria filumunun 97.08% ile mutlak bir avantaja sahip olması ve böylece diğer bakterilerin büyümesini engellemesi olabilir. Buna karşılık, GSB ve GSC durumlarındaki tohumlar uzun süre nispeten hipoksik bir ortamda bulunmuş, bu da mikroorganizmalar arasında nispeten daha az rekabetle sonuçlanmış ve mikroorganizmalar arasında önemli bir engelleyici etki görülmemiş, bu da GSA durumuna göre daha yüksek bir çeşitlilik indeksine yol açmıştır. Tohumların tüm dormansiden kurtulma süreci boyunca endofitik mantar topluluklarının çeşitliliğinde önemli bir fark görülmemiştir. Beta çeşitlilik PCoA analizi ile, endofitik bakterilerin topluluk yapısının GSA'dan GSB'ye ve ardından GSC durumuna önemli değişiklikler geçirdiği, endofitik mantarların topluluk yapısının ise tohumların fizyolojik dormansisi serbest bırakılana kadar GSA'dan GSB'ye önemli ölçüde değişmediği bulunmuştur. Qianghuo tohumları olgunlaşır ve karaya çıkar ve ancak uzun süreli sıcak ve düşük sıcaklıkta tabakalaşma işleminden sonra çimlenme kabiliyetine sahip olur. Bu süre zarfında, tohumlardaki endofitik bakteri topluluğunun yapısı değişir, bu da Qianghuo tohumlarının çimlenme kabiliyetine sahip olması için ana etki faktörlerinden biri olduğunu ve etki mekanizmasının daha fazla araştırılması gerektiğini gösterir.
Endofitik bakterilerin bitki tohumlarındaki rolü tam olarak aydınlatılamamıştır, ancak çok sayıda çalışma endofitik bakterilerin konukçu bitkiler ve tohumlar üzerinde düzenleyici etkileri olduğunu göstermiştir. Çavdardaki endofitik bakteriler sitokinin üretebilir ve bitki tarafından üretilen bitki hormonları ile etkileşime girerek tohum dormansisini düzenleyebilir. Tohumlardaki endofitik bakteriler ayrıca bitki hormonları üreterek veya bitki besin maddelerinin, özellikle de azot ve fosforun emilimini kolaylaştırarak bitki büyümesini teşvik edebilir. Bu çalışmada ayrıca GSA, GSB ve GSC'nin karakteristik mikroorganizmaları cins düzeyinde analiz edilmiştir. Toplam 15 endofitik bakteri bulunurken, endofitik mantarlarda karakteristik mikroorganizma bulunmamıştır. Bu mikroorganizmalar, diğer dormansi aşamalarına kıyasla kendi dormansi aşamalarında nispeten boldu ve Qiangfu tohumlarının morfolojik ve fizyolojik dormansisinin serbest bırakılmasında önemli bir rol oynayabilir, bu da onları gelecekteki araştırmalar için önemli bir mikrobiyal popülasyon haline getirebilir. Bunlar arasında, GSA statüsündeki baskın bakteri cinsleri Erwinia ve Pseudomonas'tır. Pseudomonas birçok meyve ve sebzenin bozulma sürecinde yer almaktadır ve bozulma bakterilerinin yaklaşık 50% ila 90%'si Pseudomonas'tır. Erwinia tarafından salgılanan pektin asit liyaz ve pektin metilgalakturonat enzimi, bitki dokularını yumuşatma üzerinde sinerjik bir etkiye sahiptir ve bu da bitki hücre duvarındaki pektini parçalayarak yumuşama ve bozulmaya neden olabilir. Bu çalışmanın sonuçları, taze hasat edilmiş Qiangfu tohumlarının bozulmayı önlemek ve tohum çimlenmesini etkilememek için derhal kumda saklanması gerektiğini göstermektedir. Huang Zhiyuan ve arkadaşları, Phyllostachys nuda bambu filizlerindeki Erwinia cinsinin göreceli bolluğunun depolama sırasında artan depolama sıcaklığı ile azaldığını bulmuştur. Bu çalışmada, taze hasat edilmiş Qiangfu tohumlarının bolluğunun, önceki araştırma sonuçlarıyla tutarlı olarak, sıcak sıcaklık uygulamasından (15 ℃) sonra önemli ölçüde azaldığı bulunmuştur. Bu durum, tohumların endosperminin sıcak sıcaklık ve kum depolama işlemine tabi tutulması ve endospermi ayrıştıran baskın bakteri cinslerinin embriyo gelişimi için büyük miktarda enerji üreterek dolaylı olarak büyümelerini engellemesiyle ilgili olabilir. Qianghuo tohumları olgunlaşıp karaya çıktığında, embriyo henüz gelişmemiştir ve morfolojik uyku halini serbest bırakmak için 8 aya kadar ılık kumda depolanması gerekir, bu da endospermde biyolojik olarak parçalanması zor çimlenme inhibitörlerinin varlığıyla ilgilidir. Kırmızı yüzme bakteri cinsi denitrifikasyon yeteneğine sahiptir ve organik maddeyi ve biyolojik olarak parçalanması zor olan bazı azot içeren bileşikleri parçalayabilen işlevsel bir bakteridir. Bu çalışma, GSB durumunda baskın endofitik bakterilerin, çimlenme inhibitörlerinin parçalanmasında ve embriyo büyümesinin desteklenmesinde rol oynayabilecek kırmızı hareketli bakteri cinsi ve Catellatospora cinsi olduğunu ve gelecekteki araştırmalar için anahtar mikrobiyal gruplar olduğunu ortaya koymuştur. GSC statüsündeki baskın bakteri cinsleri Deinococcus, Steridobacterium, Rhizobium, Mucococcus, Mycobacterium, Hydrobacteria, Micromonospora, Actinobacteria, Bacillus, Flavobacterium ve Myceticola cinsleridir. Araştırmalar, Dvoras cinsinin azot sabitleyici bir bakteri olduğunu; Yavaş büyüyen rizobilerin, bitki fotosentezinin pigment içeriğini artırabilen inorganik fosfatları çözme yeteneğine sahip olduğunu; Mycetocola suşunun ilk olarak Mi Dui Buzulu'nda keşfedildiğini ve soğuğa dayanıklı bir mikroorganizma olduğunu ortaya koymuştur. Qianghuo tohumları, sıcak kum depolamasıyla uyku halinden çıktıktan sonra çimlenme kabiliyetine sahip değildir. Çimlenebilmeleri için düşük sıcaklıkta kum depolama ile muamele edilmeleri gerekir. Dormansinin serbest bırakılmasından sonra endospermin tükeneceği ve embriyo ve embriyo kökünün daha fazla büyümesi için gereken enerjiyi karşılayamayacağı tahmin edilmektedir. Dormansinin serbest bırakılması aşamasında biriken azot içeren çimlenme inhibitörlerinin kırmızı hareketli mikroorganizmalar tarafından parçalanmasıyla üretilen azot ürünleri embriyo tarafından doğrudan emilemez. Embriyo büyümesini ve embriyo kökünün tohum kabuğundan ilerlemesini teşvik etmek için azot sabitleyici mikroorganizmalar tarafından bitki tarafından alınabilecek azota dönüştürülmeleri gerekir. Azot sabitleyici mikroorganizmaların normal olarak büyümek için Myceticola mikroorganizmalarıyla işbirliği yapması gerektiği, Myceticola mikroorganizmalarının ise sadece düşük sıcaklıklı ortamlarda normal olarak büyüyebildiği tahmin edilmektedir. Bu nedenle, Qianghuo tohumları dormansinin serbest bırakılmasından sonra bir süre geçmelidir. Sadece düşük sıcaklık uygulamasından sonra embriyonik kök tohum kabuğunu kırabilir, Tohumlar çimlenme yeteneğine sahip olabilir. GSC durumu embriyolarındaki yavaş büyüyen rizobinin karakteristik mikroorganizmalarının, embriyolarda fotosentez için hazırlanarak embriyolarda fotosentetik pigmentlerin içeriğini artırabileceği tahmin edilmektedir.
Qianghuo tohumlarının prototip embriyo olarak veya embriyosuz olarak olgunlaşması ve inmesi nedeniyle, yapay yetiştirme sırasında tohum embriyolarının büyümesi çok yavaştır, bu da Qianghuo tohumlarının çimlenme süresinin uzun ve çimlenme sürecinin zor olmasına neden olur. Doğal halde çimlenmesi 11 ay kadar sürmektedir. Tohum embriyolarının morfolojik ve fizyolojik uyuşukluklarını serbest bırakmak için büyümelerini teşvik eden mikroorganizmalar perspektifinden mikroorganizmaların bulunması ve Qianghuo'nun yapay yetiştiriciliğinin geliştirilmesi için güçlü bir destek sağlanması acildir. Bu deney, Qiangfu tohumlarının farklı dormansi durumlarındaki endofitik bakteri ve mantarların topluluk yapısı kompozisyonu ve farklılıkları üzerine, ekimsiz yüksek verimli dizileme yöntemleri aracılığıyla derinlemesine bir çalışma yürütmüştür. Her bir dormansi durumunun karakteristik mikroorganizmaları analiz edilmiştir. Bu makale, Qiangfu tohumlarının dormansisini gidermek için mikrobiyal yöntemlerin kullanılmasına yönelik yeni bir fikir sunmakta, tohum dormansisinin salınımının mikrobiyal teşviki araştırma alanındaki boşluğu doldurmakta ve Qiangfu tohumlarının çimlenme oranını iyileştirmek ve yapay yetiştiricilikte standart gelişimlerini teşvik etmek için dormansi salınımını teşvik edici etkilere sahip bu potansiyel endofitik bakteri kaynaklarının daha fazla kullanılması için temel oluşturmaktadır. Tohum dormansisini hızlı bir şekilde gidermek için mühendislik suşları veya mikrobiyal preparatlar gibi mikrobiyal yöntemlerin kullanımı için teorik rehberlik sağlaması beklenmektedir.