Analyse af sammensætningen og forskellene i endofytiske bakteriesamfund i forskellige hviletilstande af Qianghuo-frø
Notopterygium incisum Ting ex H. T. Chang er en planteart i familien Umbelliferae. Dens tørrede jordstængler bruges som medicin og er almindeligt anvendt i traditionel kinesisk og tibetansk medicin, almindeligvis kendt som sort medicin. Den har en stor efterspørgsel på markedet. På nuværende tidspunkt kommer Qianghuo hovedsageligt fra vilde ressourcer og er hovedsageligt udbredt i buskgræsarealer i 3000-4500 meters højde i Sichuan, Gansu, Qinghai og andre steder. I de senere år har overdreven udgravning forårsaget stor skade på det økologiske miljø, og de vilde Qiang-ressourcer er ved at være udtømt. Derfor er der et presserende behov for kunstig domesticering og dyrkning.
Når frøene af Qianghuo modnes og lander, er embryoudviklingen ufuldstændig, og der er ofte intet embryo eller et primitivt embryofænomen. Den har en dobbelt dvaletilstand, der er karakteristisk for morfologi og fysiologi, og hører til frø med dyb dvaletilstand. Spirehastigheden for Qianghuo-frø i naturlige miljøer er ekstremt lav (0,52%). Den nuværende effektive metode til at lindre Qianghuo-frøenes dvale er GA + sandopbevaringsmetode med variabel temperatur. For det første bruges sandopbevaringsmetoden ved varm temperatur til at lindre deres morfologiske dvaletilstand, og derefter kræves sandopbevaringsbehandling ved lav temperatur for at lindre deres fysiologiske dvaletilstand, før frøene kan have spireevne. Frøbehandlingen kan vare i mere end 8 måneder. Ved at bruge denne metode til at behandle Qianghuo-frø er den højeste spirehastighed 21,2%. Desuden er vækstcyklussen for Qianghuo-medicinske urter over 4 år, og på grund af den lange investeringscyklus og langsomme effektivitet er udviklingen af kunstig dyrkning meget langsom. I øjeblikket er der kun sporadisk dyrkning til rådighed, hvilket ikke kan opfylde Qianghuo-markedets behov for bæredygtig udvikling. Teknologien til manuelt at udløse Qianghuo-frøenes dvale har ikke gjort banebrydende fremskridt i det seneste årti, hvilket er et af de største problemer, der begrænser dyrkningen af Qianghuo i stor skala.
Endofytiske bakterier i planter henviser til svampe eller bakterier, der lever i forskellige væv og organer i sunde planter i visse eller alle stadier af deres livscyklus. De danner et komplekst og specielt mutualistisk forhold til værtsplanten i langvarig sameksistens og fremmer celledeling, rodudvikling og frøplantevækst ved at øge metabolismen af auxin og mitogener i planten. Frøenes dvale styres af balancen mellem gibberellin-vækstfremmere og abscisinsyre-væksthæmmere. Forskning har vist, at endofytiske bakterier kan regulere frøhvilen ved at regulere eller inducere syntesen af endogene hormoner i planter, hvilket giver et teoretisk grundlag for at udforske endofytiske bakterieressourcer med vækstfremmende funktioner i frø. Pu Fengya et al. fandt ud af, at endofytiske bakterier i Jobs tårer kan øge spirehastigheden for Jobs tårer, ris og hvedefrø og fremme kimplanternes vækst ved at inducere rodvækst. Lei Ruifeng opdagede, at endofytiske bakterier i sølvsandhoppefrø fremmer frøspiring ved at regulere frømetabolismen. Xiang Yiqing og andre fandt ud af, at endofytiske bakterier i Huanglian-frø kan forbedre spiringshastigheden for Huanglian-frø betydeligt. De endofytiske bakterier i Sichuan-peber (Capsicum annuum), ris (Oryza sativa L.) og Dendrobium catenatum fremmer direkte vækst og udvikling af værtsplanter ved at udskille endogene hormoner som auxin, abscisinsyre, cytokinin, gibberellinsyre osv. De endofytiske bakterier, der er isoleret fra frø af Achnatherum inebrians, Dendrobium nobile og Lolium rigidum, samt de endofytiske bakterier, der er isoleret fra rødderne af Polygonatum multiflorum L., regulerer frøhvilen ved at udskille endogene hormoner som cytokinin, hvilket forbedrer deres spiring og overlevelsesrate betydeligt. Men kan de endofytiske bakterier i Qianghuo-frø fremme frigivelsen af dvale ved at fremme væksten af dets embryo? På baggrund af dette tager dette eksperiment Qianghuo-frø som forskningsobjekt og bruger Illumina MiSeq culture free high-throughput sequencing-teknologi til at undersøge sammensætningen og forskellene i endofytiske bakteriesamfund i forskellige dvaletilstande i Qianghuo-frø. Dette giver et teoretisk grundlag for yderligere forskning i brugen af mikroorganismer til at lindre Qianghuo-frøets dvale og giver også vigtige teoretiske referencer til dyrkning af planter med lignende dvaleegenskaber.

Som et vigtigt reproduktionsorgan for planter kan frø fungere som et medium for overførsel af gavnlige mikroorganismer fra moderplanter til den næste generation gennem vertikal formering og derved fremme frøspiring og kimplantevækst. Endofytiske bakterier i frø af græsser som ris og majs spiller en vigtig rolle i frøspiring, frøplanternes vækst og udvikling samt værtsplantens vækst. Frøene af Dendrobium nobile Lindl. udviser eftermodning og mangler endospermvæv, hvilket kræver symbiose med mikroorganismer for at kunne spire. De dominerende endofytiske bakterier er hovedsageligt proteobakterier og cyanobakterier. Denne undersøgelse viste, at Qianghuo-frø er i tre forskellige hviletilstande, og at typerne af endofytiske bakteriesamfund er ens på fylumniveau. De endofytiske bakterier består hovedsageligt af Proteobacteria, Actinobacteria og Firmicutes, hvilket er i overensstemmelse med de dominerende endofytiske bakteriefamilier i andre plantefrø. Sammenlignet med Dendrobium officinale-frø er der dog forskelle i de dominerende endofytiske bakteriefamilier. Typerne af plantesekretioner og mikroorganismernes evne til at kolonisere, overleve og sprede sig til frø varierer, hvilket resulterer i forskelle i endofytiske bakterier i forskellige plantefrø. Fordi endofytiske bakterier i frø kommer fra forskellige planteorganer eller meristematiske væv, overføres og koloniserer de frøembryoet og endospermen gennem mikrotubuliforbindelser eller gameter og spredes vertikalt. Frøene fra lægeplanterne Qianghuo og Dendrobium officinale har begge svært ved at spire på grund af deres dvaleegenskaber. Undersøgelser har dog vist, at de dominerende endofytiske bakteriegrupper hos de to er forskellige, hvilket kan skyldes deres forskellige kilder til endofytiske bakterier. Qianghuo-frø er i dvale på grund af ufuldstændig embryoudvikling, og deres endofytiske bakterier kommer hovedsageligt fra endospermen, mens Dendrobium officinale-frø er i dvale på grund af manglende endosperm. Deres endofytiske bakterier kommer hovedsageligt fra embryoet, så der er forskelle i fylumtyperne mellem de to. Det spekuleres i, at Qianghuo-frø også skal eksistere sammen med mikroorganismer for at kunne spire. En lille mængde endofytiske bakterier, der tilhører fylum Bacteroidetes (2,01%), optrådte i frøene fra Qianghuo i GSC-tilstanden, mens ukendte endofytiske svampe, der tilhører fylum Bacteroidetes, optrådte i 24,33% og 7,74% af frøene i henholdsvis GSB- og GSC-tilstanden. Disse endofytiske bakterier kan spille en vigtig rolle i at fremme frøembryovæksten og ophæve frøhvilen, og de vil være i fokus for fremtidig forskning. Endofytiske svampe findes i stor mængde og mangfoldighed i mange planters frø. De endofytiske svampe i Qianghuo-frø består hovedsageligt af Ascomycota og Basidiomycota, hvilket er i overensstemmelse med de dominerende endofytiske svampe i Phaseolus vulgaris L.-frø og Dendrobium nobile-frø.

På slægtsniveau ændres sammensætningen af endofytiske bakteriesamfund fra GSA- til GSB-status, og typerne af endofytiske bakteriesamfund er ens fra GSB til GSC. Gennem Alpha-diversitetsanalyse blev det konstateret, at diversiteten af endofytiske bakterier i GSA var signifikant lavere end i GSB og GSC, mens der ikke var nogen signifikant forskel i diversiteten af endofytiske bakterier mellem GSB og GSC. Hovedårsagen kan være, at i GSA-tilstanden havde Proteobacteria-gruppen en absolut fordel, idet den tegnede sig for 97,08% og derved hæmmede væksten af andre bakterier. I modsætning hertil var frøene i GSB- og GSC-tilstandene i et relativt hypoxisk miljø i lang tid, hvilket resulterede i relativt mindre konkurrence mellem mikroorganismer og ingen signifikant hæmmende effekt mellem mikroorganismer, hvilket førte til et højere diversitetsindeks end i GSA-tilstanden. Der var ingen signifikant forskel i diversiteten af endofytiske svampesamfund under hele processen med at frigøre frøene fra dvalen. Gennem Beta Diversity PCoA-analyse blev det konstateret, at samfundsstrukturen for endofytiske bakterier gennemgik betydelige ændringer fra GSA til GSB og derefter til GSC-tilstand, mens samfundsstrukturen for endofytiske svampe ikke ændrede sig væsentligt fra GSA til GSB, før frøenes fysiologiske dvaletilstand blev frigivet. Qianghuo-frø modnes og lander og har kun spireevne efter langvarig varm og lav temperatur-stratificeringsbehandling. I løbet af denne periode ændres strukturen af det endofytiske bakteriesamfund i frøene, hvilket indikerer, at dette er en af de vigtigste påvirkningsfaktorer for, at Qianghuo-frø har spireevne, og dets virkningsmekanisme skal undersøges yderligere.
Endofytiske bakteriers rolle i plantefrø er ikke klarlagt, men et stort antal undersøgelser har vist, at endofytiske bakterier har regulerende virkninger på værtsplanter og frø. De endofytiske bakterier i rajgræs kan producere cytokininer og interagere med plantehormoner, der produceres af planten, og derved regulere frøhvilen. Endofytiske bakterier i frø kan også fremme plantevækst ved at producere plantehormoner eller lette optagelsen af plantenæringsstoffer, især kvælstof og fosfor. Denne undersøgelse analyserede yderligere de karakteristiske mikroorganismer i GSA, GSB og GSC på slægtsniveau. Der var i alt 15 endofytiske bakterier og ingen karakteristiske mikroorganismer i endofytiske svampe. Disse mikroorganismer var relativt talrige i deres respektive hvilestadier sammenlignet med andre hvilestadier og kan spille en vigtig rolle i frigivelsen af morfologisk og fysiologisk dvale i Qiangfu-frø, hvilket gør dem til en vigtig mikrobiel population for fremtidig forskning. Blandt dem er de dominerende bakterieslægter i GSA-status Erwinia og Pseudomonas. Pseudomonas er involveret i fordærvelsesprocessen af mange frugter og grøntsager, og omkring 50% til 90% af fordærvelsesbakterierne er Pseudomonas. Pektinsyrelyasen og pektinmethylgalacturonat-enzymet, der udskilles af Erwinia, har en synergistisk effekt på blødgøring af plantevæv, hvilket kan nedbryde pektinet på plantecellevæggen og forårsage blødgøring og fordærv. Resultaterne af denne undersøgelse viser, at friskhøstede Qiangfu-frø straks skal opbevares i sand for at forhindre ødelæggelse og påvirke frøenes spiring. Huang Zhiyuan et al. fandt, at den relative forekomst af Erwinia-slægten i Phyllostachys nuda-bambusskud faldt med stigende opbevaringstemperatur under opbevaring. Denne undersøgelse viste, at mængden af friskhøstede Qiangfu-frø faldt betydeligt efter varmebehandling (15 °C), hvilket er i overensstemmelse med tidligere forskningsresultater. Det kan hænge sammen med, at frøenes endosperm blev udsat for varm temperatur og sandopbevaring, og de dominerende bakterieslægter, der nedbrød endospermen, producerede en stor mængde energi til embryoudvikling, hvilket indirekte hæmmede deres vækst. Når Qianghuo-frøene modnes og lander, er embryoet endnu ikke udviklet og skal opbevares i varmt sand i op til 8 måneder for at frigøre sin morfologiske dvale, hvilket hænger sammen med tilstedeværelsen af spiringshæmmere, der er svære at nedbryde biologisk, i endospermen. Den røde svømmebakterieslægt har denitrifikationsevne og er en funktionel bakterie, der kan nedbryde organisk materiale og nogle kvælstofholdige forbindelser, der er vanskelige at nedbryde biologisk. Denne undersøgelse viste, at de dominerende endofytiske bakterier i GSB-tilstanden er slægten røde svømmebakterier og Catellatospora-slægten, som kan spille en rolle i nedbrydningen af spiringshæmmere og fremme embryovæksten, og som er de vigtigste mikrobielle grupper for fremtidig forskning. De dominerende bakterieslægter i GSC-status er slægterne Deinococcus, Steridobacterium, Rhizobium, Mucococcus, Mycobacterium, Hydrobacteria, Micromonospora, Actinobacteria, Bacillus, Flavobacterium og Myceticola. Forskning har vist, at slægten Dvoras er en kvælstoffikserende bakterie; Langsomt voksende rhizobier har evnen til at opløse uorganiske fosfater, hvilket kan øge pigmentindholdet i planternes fotosyntese; Mycetocola-stammen blev oprindeligt opdaget på Mi Dui-gletscheren og er en kulderesistent mikroorganisme. Qianghuo-frø har ikke evnen til at spire, efter at de er blevet frigjort fra dvale ved opbevaring i varmt sand. De skal behandles med sandopbevaring ved lav temperatur, før de kan spire. Det antages, at endospermen vil være opbrugt efter frigivelsen af dvalen og ikke være i stand til at levere den energi, der er nødvendig for yderligere vækst af embryo og embryorod. De kvælstofprodukter, der produceres ved nedbrydning af kvælstofholdige spirehæmmere af røde, bevægelige mikroorganismer, som er akkumuleret under frigørelsesfasen, kan ikke optages direkte af embryoet. De skal omdannes til kvælstof, der kan optages af planten af kvælstoffikserende mikroorganismer for at fremme embryovækst og embryorodgennembrud gennem frøkappen. Det spekuleres i, at kvælstoffikserende mikroorganismer skal samarbejde med Myceticola-mikroorganismer for at vokse normalt, mens Myceticola-mikroorganismer kun kan vokse normalt i miljøer med lav temperatur. Derfor skal Qianghuo-frø gennemgå en periode efter frigivelsen af dvaletilstanden. Først efter behandling ved lav temperatur kan den embryonale rod bryde gennem frøskallen, og frøene har evnen til at spire. Det spekuleres i, at de karakteristiske mikroorganismer i langsomt voksende rhizobia i embryoner i GSC-tilstand kan øge indholdet af fotosyntetiske pigmenter i embryoner og forberede fotosyntesen i embryoner.
På grund af det faktum, at Qianghuo-frø modnes og lander som prototypeembryoner eller uden embryoner, er væksten af frøembryoner under kunstig dyrkning meget langsom, hvilket resulterer i lang spiringstid og vanskelig spiringsproces af Qianghuo-frø. Det tager op til 11 måneder at spire i naturlig tilstand. Det haster med at finde mikroorganismer, der fremmer væksten af frøembryoner for at frigøre deres morfologiske og fysiologiske dvale, hvilket giver stærk støtte til udviklingen af kunstig dyrkning af Qianghuo. Dette eksperiment udførte en dybdegående undersøgelse af samfundsstrukturens sammensætning og forskelle i endofytiske bakterier og svampe i forskellige dvaletilstande af Qiangfu-frø gennem dyrkningsfrie high-throughput-sekventeringsmetoder. De karakteristiske mikroorganismer i hver hviletilstand blev analyseret. Denne artikel giver en ny idé til at bruge mikrobielle metoder til at lindre Qiangfu-frøenes dvale, udfylder hullet i forskningsfeltet for mikrobiel fremme af frigørelse af frødvale og lægger grundlaget for yderligere at udnytte disse potentielle endofytiske bakterieressourcer med virkninger, der fremmer frigørelse af dvale, til at forbedre Qiangfu-frøenes spirehastighed og fremme deres standardiserede udvikling i kunstig dyrkning. Den forventes at give teoretisk vejledning i brugen af mikrobielle metoder som f.eks. tekniske stammer eller mikrobielle præparater til hurtigt at ophæve frøhvilen.