Moleküler yerleştirme ve enzim inhibisyon kinetiğine dayanarak, Rhodiola rosea'dan ekstrakte edilen α - glukozidazın in vitro inhibitör aktivitesini araştırın. diyabet, iki türe ayrılabilen yaygın bir hastalıktır: diyabet tip 1 (T1DM) ve diyabet tip 2 (T2DM). T2DM, diyabet hastalarının 90%'sinden fazlasını oluşturur ve esas olarak insülin direnci ve anormal insülin salgılanması nedeniyle artan postprandiyal kan glikozundan kaynaklanır. Alfa glukozidaz, postprandiyal hiperglisemiye neden olan ana enzimlerden biridir ve alfa glukozidaz aktivitesini inhibe etmek, postprandiyal hiperglisemiyi kontrol etmenin ve T2DM'yi tedavi etmenin ana yolu haline gelmiştir. Günümüzde, klinik uygulamada yaygın olarak kullanılan alfa glukozidaz inhibitörleri akarboz, miglitol vb.dir. Yüksek inhibitör aktiviteye sahip olmalarına rağmen pahalıdırlar ve hazımsızlık gibi bir dizi gastrointestinal reaksiyona eğilimlidirler. Bitkilerden elde edilen doğal ürünler, düşük toksisiteleri ve yan etkileri nedeniyle yüksek kaliteli terapötik ajan kaynakları haline gelmiştir. Bu nedenle, doğal aktif maddelerden güvenli ve düşük advers reaksiyonlu alfa glukozidaz inhibitörlerinin araştırılması bir araştırma noktası haline gelmiştir.

Gıda ve ilaç homolojisine sahip geleneksel Çin tıbbi malzemelerinden biri olan Rhodiola sachalinensis, salidroside, kateşin, tirosol ve diğer aktif bileşenleri içerir. Şu anda, yurtiçi ve yurtdışındaki araştırmalar esas olarak anti hipoksi, anti apoptoz, anti-tümör, stres hasarını hafifletme vb. üzerine odaklanmaktadır. Bazı çalışmalar ayrıca diyabet kemirgen modellerinde belirli bir rolü olduğunu ve 5 '- adenozin monofosfat bağımlı protein kinaz (AMPK) ile ilgili sinyal yollarını aktive ederek diyabet farelerinde hiperglisemi, hiperlipidemi ve idrar şekeri semptomlarını hafifletebileceğini göstermektedir. Son zamanlarda, araştırmacılar Rhodiola özütünün farelerde yemek sonrası kan şekeri seviyelerini önemli ölçüde azaltabildiğini ve aktif bileşenlerinin in vitro olarak belirli bir derecede inhibitör etki sergilediğini, ancak spesifik inhibisyon mekanizmasının net olmadığını bulmuşlardır. Ekibimizin ön araştırması, Rhodiola rosea'daki polifenolik maddelerin belirli in vitro alfa glukozidaz inhibitör aktivitesine sahip olduğunu buldu. Yukarıdaki araştırma geçmişine dayanan bu çalışma, Rhodiola rosea özütünün alfa glukozidaz üzerindeki inhibitör etkisini görselleştirilmiş bir şekilde araştırmak için enzim inhibisyon kinetiği, UHPLC-QE-MS ve moleküler yerleştirme teknolojisini birleştirmektedir. Araştırma, Rhodiola rosea'nın daha fazla geliştirilmesini ve kullanılmasını teşvik etmek amacıyla hipoglisemik ilaçların ve sağlıklı gıdaların geliştirilmesi için teorik referans sağlamayı amaçlamaktadır.

 

 

Alfa glukozidaz vücutta ince bağırsak mukozasının fırça sınırında bulunur ve oligosakkaritleri veya disakkaritleri monosakkaritlere parçalayabilir. Aktivitesinin engellenmesi karbonhidrat hidrolizini ve glikoz üretim hızını yavaşlatabilir, böylece ince bağırsak tarafından glikoz emilimini ve yemek sonrası kan glikozunu azaltabilir. Araştırmalar yıldız elması, fil bacağı muzu, siyah kurt üzümü, Schisandra chinensis, mor yer elması ve Guizhou karahindibası gibi çeşitli bitkilerden elde edilen özütlerin hepsinin alfa glukozidaza karşı inhibitör aktiviteye sahip olduğunu göstermektedir. Yarı maksimal inhibitör konsantrasyon (IC50), inhibitörlerin enzimler üzerindeki inhibitör etkisini değerlendirmek için kullanılabilir. IC50 ne kadar küçükse, inhibitör aktivite o kadar yüksektir. Ekibin önceki araştırması, Rhodiola polifenollerinin alfa glukozidaz üzerinde 2,83 mg/mL IC50 ile iyi bir inhibitör etkiye sahip olduğunu göstermiştir. Bu deneyde elde edilen RCE IC50 değeri 1,538 mg/mL olup, bu değer sadece akarbozdan değil, aynı zamanda Rhodiola polifenollerinden de daha düşüktür. Bunun nedeni RCE'deki flavonoidler, organik asitler ve diğer maddelerin varlığı olabilir. İnhibitörler tarafından enzim inhibisyonu türleri geri dönüşümlü inhibisyon ve geri dönüşümsüz inhibisyon olarak ikiye ayrılabilir. Bu çalışmada elde edilen RCE ve α - glukozidaz, inhibitör ve enzim arasında kovalent olmayan bağlanma ile karakterize edilen ve fiziksel yöntemlerle enzim aktivitesini geri kazandırabilen tersinir inhibisyondur. Tersinir inhibisyon türleri ayrıca dört kategoriye ayrılabilir: yarışmalı inhibisyon, yarışmalı olmayan inhibisyon, anti yarışmalı inhibisyon ve karışık inhibisyon. Karışık inhibisyon türleri rekabetçi ve rekabetçi olmayan karışık inhibisyonu içerir. Bu türün özelliği, inhibitör konsantrasyonundaki bir artışın enzimatik reaksiyonun maksimum reaksiyon hızını (Vmax) azaltması ve Michaelis sabitini (Km) artırmasıdır. Bu çalışma, RCE konsantrasyonundaki bir artışın Vmax'ta bir azalmaya yol açtığını göstermektedir Km'deki artış yukarıdaki özelliklerle tutarlıdır, bu nedenle RCE'nin α-glukozidaz üzerindeki inhibisyon tipi, Rhodiola özütünün etkili bir doğal α-glukozidaz inhibitörü olduğunu gösteren karma bir rekabetçi ve rekabetçi olmayan inhibisyon tipi olarak belirlenmiştir. RCE, Rhodiola rosea'dan elde edilen polifenoller, Schisandra chinensis'ten elde edilen polisakkaritler ve Scenedesmus macrophylla'dan elde edilen polisakkaritler tarafından α-glukozidazın inhibisyon tipleriyle tutarlıdır. Bununla birlikte, hangi bileşiklerin rekabetçi inhibisyona ve hangi bileşiklerin rekabetçi olmayan inhibisyona ait olduğunun açıklığa kavuşturulması ve daha fazla araştırmaya ihtiyaç vardır. RCE iyi bir α - glukozidaz inhibitör aktivitesine sahiptir, ancak etkinin in vivo olarak anlamlı olup olmadığını doğrulamak için daha fazla hayvan modeline ihtiyaç vardır. Şu anda, başta bira mayası, Aspergillus niger, termofilik Bacillus subtilis ve Leuconostoc enterica olmak üzere birçok alfa glukozidaz kaynağı bulunmaktadır. Farklı kaynaklardan elde edilen α-glukozidazın özellikleri büyük ölçüde farklılık göstermektedir ve bu çalışmada kullanılan α-glukozidaz bira mayasından elde edilmiştir. Bu nedenle, RCE'nin diğer kaynaklardan gelen enzimler üzerinde aynı inhibitör etkiye sahip olup olmadığını belirlemek için daha fazla araştırmaya ihtiyaç vardır.
UHPLC-QE-MS hız ve doğruluk özelliklerine sahiptir ve karmaşık Çin tıbbi malzemelerindeki bileşiklerin hedef dışı analizi için kullanılabilir. Bu çalışmada RCE analiz edilmiş ve negatif iyon modunda 263 bileşik ve pozitif iyon modunda 982 bileşik dahil olmak üzere veri tabanı ile karşılaştırılarak 1245 bileşik tanımlanmıştır. Rhodiola rosea'nın aktif bileşenlerinin ekstraksiyonu için ana çözücüler etanol ve sudur. Saf su ile karşılaştırıldığında, organik çözücülerin sulu çözeltileri daha fazla bileşiği ekstrakte edebilir. Sulu ekstrakttaki gallik asit içeriği alkol ekstraktındakinden daha yüksekken, tirozol, klorojenik asit ve tanen içeriği su alkol ekstraktındakinden daha düşüktür. Bu nedenle, daha fazla bileşik elde etmek amacıyla, bu deneyde RCE ekstraksiyonu hazırlığı için çözücü olarak 50% etanol kullanılmıştır. Bununla birlikte, tek ekstraksiyon çözücüsü nedeniyle, tespit edilen bileşikler mutlaka Rhodiola rosea'nın tüm bileşikleri olmayabilir ve hala ekstrakte edilemeyen veya tanımlanamayan bazı bileşikler vardır. Bu nedenle, farklı ekstraksiyon çözücüleriyle daha fazla karşılaştırmalı deney yapılması gerekmektedir. Zakharenko'nun araştırması Rhodiola rosea'daki ana aktif bileşenlerin salidrosid, luteolin, kateşin, kuersetin, bitkisel ekstrakt ve kateşin olduğunu göstermektedir. RCE yüksek düzeyde luteolin ve kuersetin içerdiğinden, bu çalışmanın sonuçlarıyla tutarlıdır. Moleküler yerleştirme, küçük moleküllü ligandların reseptör proteinlerine bağlanıp bağlanamayacağını ve ilgili bağlanma kuvvetlerini tahmin edebilir. Bu çalışmada, UHPLC-QE-MS'den elde edilen yüksek içerikli 20 bileşik α-glukozidaz ile kenetlenmiştir. Sonuçlar, luteolin, salidrosid, kaempferol, (-) - epikateşin 3-O-gallat, kafeik asit, L-malik asit, (+) - epikateşin, kuersetin, (-) - eritrotro-anetol glikol 1-glukozit, 3-hidroksi-4,6-heptyne-1-il 1-glukozit ve tirozol dahil olmak üzere 11 bileşiğin α - glukozidaza bağlanabildiğini göstermiştir. Bunlar arasında kafeik asit en fazla hidrojen bağını oluşturmuştur. His-515, Arg-437, Glu-432 ve His-348 kalıntılarına bağlanabilir. (+) - Epikateşin, en düşük bağlanma enerjisi (-17,08 kJ/mol) ile Asn-443 ve His-515 ile en iyi bağlanma aktivitesine sahiptir; PNPG'nin α-glukozidaz ile kenetlenmesi, Arg-437 ve Glu-432'nin iki bağlanma bölgesi olduğunu ortaya koymuştur. Kafeik asit PNPG, Arg-437 ve Glu-432 ile aynı bağlanma bölgelerini paylaşırken, L-malik asit, kuersetin ve tirozol PNPG, Arg-437 ile aynı bağlanma bölgesini paylaşmaktadır. Bu nedenle, kafeik asit, L-malik asit, kuersetin ve tirozolün α-glukozidaz üzerindeki inhibisyon türlerinin rekabetçi inhibisyon olabileceği, diğer altı bileşiğin ise rekabetçi olmayan inhibisyon olduğu sonucuna varılmıştır. Bununla birlikte, inhibisyon türlerini belirlemek için bileşiklerin daha fazla saflaştırılması ve Lineweaver Burk karşılıklı grafikleri gerekmektedir.
Özetle, bu çalışmada RCE'nin α-glukozidaz üzerindeki inhibitör etkisi enzim inhibisyon kinetiği, UHPLCQE-MS ve moleküler kenetlenme teknikleri aracılığıyla görselleştirilmiş bir şekilde araştırılmıştır. İnhibisyon tipi, rekabetçi ve rekabetçi olmayan inhibisyonun karışık bir tipiydi ve (+) - epikateşin ile α - glukozidaz arasındaki bağlanma aktivitesi RCE'de en iyisiydi. Bu makale, doğal bir alfa glukozidaz inhibitörü olarak RCE'nin geliştirilmesi ve Rhodiola kaynaklarının kullanımı için temel araştırma sağlamaktadır.