Auf der Grundlage von molekularem Docking und Enzymhemmungskinetik wird die hemmende Aktivität von α-Glucosidase aus Rhodiola rosea in vitro untersucht. Diabetes ist eine weit verbreitete Krankheit, die in zwei Typen unterteilt werden kann: Diabetes Typ 1 (T1DM) und Diabetes Typ 2 (T2DM). T2DM macht mehr als 90% der Diabetespatienten aus und wird hauptsächlich durch einen erhöhten postprandialen Blutzuckerspiegel aufgrund von Insulinresistenz und abnormaler Insulinsekretion verursacht. Die Alpha-Glucosidase ist eines der wichtigsten Enzyme, die eine postprandiale Hyperglykämie verursachen, und die Hemmung der Alpha-Glucosidase-Aktivität ist zur wichtigsten Methode zur Kontrolle der postprandialen Hyperglykämie und zur Behandlung von T2DM geworden. Die derzeit in der klinischen Praxis am häufigsten verwendeten Alpha-Glucosidase-Hemmer sind Acarbose, Miglitol usw. Obwohl sie eine hohe Hemmaktivität aufweisen, sind sie teuer und neigen zu einer Reihe von gastrointestinalen Reaktionen wie Verdauungsstörungen. Natürliche, aus Pflanzen gewonnene Produkte sind aufgrund ihrer geringen Toxizität und Nebenwirkungen zu hochwertigen Quellen für therapeutische Wirkstoffe geworden. Daher ist die Suche nach sicheren und nebenwirkungsarmen Alpha-Glucosidase-Inhibitoren aus natürlichen Wirkstoffen zu einem Forschungsschwerpunkt geworden.

Rhodiola sachalinensis, eines der traditionellen chinesischen Heilmittel mit Lebensmittel- und Medizinhomologie, enthält Salidrosid, Catechin, Tyrosol und andere aktive Bestandteile. Gegenwärtig konzentriert sich die Forschung im In- und Ausland hauptsächlich auf die Bekämpfung von Hypoxie, Apoptose, Tumoren, Stressschäden usw. Einige Studien zeigen auch, dass es eine gewisse Rolle bei Diabetes-Nagetiermodellen spielt und Hyperglykämie, Hyperlipidämie und Urinzuckersymptome bei Diabetes-Mäusen durch die Aktivierung von 5'- Adenosinmonophosphat-abhängigen Proteinkinasen (AMPK) im Zusammenhang mit Signalwegen lindern kann. Kürzlich haben Forscher herausgefunden, dass Rhodiola-Extrakt den postprandialen Blutzuckerspiegel bei Mäusen deutlich senken kann, und seine Wirkstoffe zeigen in vitro einen gewissen Grad an hemmender Wirkung, aber der spezifische Hemmungsmechanismus ist nicht klar. Die Voruntersuchungen unseres Teams ergaben, dass die polyphenolischen Substanzen in Rhodiola rosea in vitro eine gewisse hemmende Wirkung auf die Alpha-Glucosidase haben. Auf der Grundlage des oben genannten Forschungshintergrunds werden in dieser Studie Enzyminhibitionskinetik, UHPLC-QE-MS und molekulare Docking-Technologie kombiniert, um die hemmende Wirkung von Rhodiola rosea-Extrakt auf Alpha-Glucosidase in einer visualisierten Weise zu untersuchen. Die Forschung zielt darauf ab, theoretische Referenzen für die Entwicklung von hypoglykämischen Medikamenten und gesunden Lebensmitteln zu liefern, um die weitere Entwicklung und Nutzung von Rhodiola rosea zu fördern.

 

 

Alpha-Glucosidase kommt im Bürstensaum der Dünndarmschleimhaut im Körper vor und kann Oligosaccharide oder Disaccharide in Monosaccharide aufspalten. Die Hemmung ihrer Aktivität kann die Kohlenhydrathydrolyse und die Glukoseproduktionsrate verlangsamen und so die Glukoseaufnahme im Dünndarm und den postprandialen Blutzuckerspiegel senken. Untersuchungen zeigen, dass Extrakte aus verschiedenen Pflanzen wie Sternapfel, Elefantenbeinbanane, Schwarze Wolfsbeere, Schisandra chinensis, Purpur-Yam und Guizhou-Löwenzahn alle eine hemmende Wirkung auf die Alpha-Glucosidase haben. Die halbe maximale Hemmkonzentration (IC50) kann zur Bewertung der hemmenden Wirkung von Inhibitoren auf Enzyme verwendet werden. Je kleiner die IC50, desto höher die hemmende Wirkung. Frühere Forschungsarbeiten des Teams haben gezeigt, dass Rhodiola-Polyphenole eine gute hemmende Wirkung auf Alpha-Glucosidase haben, mit einer IC50 von 2,83 mg/ml. Der in diesem Experiment ermittelte RCE-IC50-Wert liegt bei 1,538 mg/ml und ist damit nicht nur niedriger als Acarbose, sondern auch niedriger als die Rhodiola-Polyphenole. Dies könnte auf das Vorhandensein von Flavonoiden, organischen Säuren und anderen Substanzen in RCE zurückzuführen sein. Die Arten der Enzymhemmung durch Inhibitoren können in reversible Hemmung und irreversible Hemmung unterteilt werden. Bei den in dieser Studie gewonnenen RCE und α-Glucosidase handelt es sich um eine reversible Hemmung, die durch eine nicht kovalente Bindung zwischen dem Inhibitor und dem Enzym gekennzeichnet ist und die Enzymaktivität durch physikalische Methoden wiederherstellen kann. Die reversiblen Hemmungsarten lassen sich in vier Kategorien unterteilen: kompetitive Hemmung, nicht kompetitive Hemmung, antikompetitive Hemmung und gemischte Hemmung. Zu den gemischten Inhibitionsarten gehören die kompetitive und die nicht kompetitive gemischte Inhibition. Charakteristisch für diesen Typ ist, dass eine Erhöhung der Hemmstoffkonzentration die maximale Reaktionsgeschwindigkeit (Vmax) der enzymatischen Reaktion verringert und die Michaelis-Konstante (Km) erhöht. Diese Studie zeigt, dass eine Erhöhung der RCE-Konzentration zu einer Verringerung von Vmax führt. Die Erhöhung von Km steht im Einklang mit den oben genannten Merkmalen, so dass die Art der Hemmung von RCE auf α-Glucosidase als gemischter Typ von kompetitiver und nicht kompetitiver Hemmung bestimmt wird, was darauf hinweist, dass Rhodiola-Extrakt ein wirksamer natürlicher α-Glucosidase-Hemmer ist. RCE stimmt mit den Hemmungsarten der α-Glucosidase durch Polyphenole aus Rhodiola rosea, Polysaccharide aus Schisandra chinensis und Polysaccharide aus Scenedesmus macrophylla überein. Es muss jedoch geklärt werden, welche Verbindungen zu einer kompetitiven Hemmung und welche zu einer nicht kompetitiven Hemmung gehören, und es sind weitere Untersuchungen erforderlich. RCE hat eine gute α-Glucosidase-Hemmaktivität, aber es sind weitere Tiermodelle erforderlich, um zu überprüfen, ob die Wirkung in vivo signifikant ist. Gegenwärtig gibt es viele Quellen für Alpha-Glucosidase, vor allem Brauereihefe, Aspergillus niger, thermophiler Bacillus subtilis und Leuconostoc enterica. Die Eigenschaften der α-Glucosidase aus verschiedenen Quellen sind sehr unterschiedlich, und die in dieser Studie verwendete α-Glucosidase stammt aus Brauereihefe. Daher sind weitere Untersuchungen erforderlich, um festzustellen, ob RCE die gleiche hemmende Wirkung auf Enzyme aus anderen Quellen hat.
Die UHPLC-QE-MS zeichnet sich durch Schnelligkeit und Genauigkeit aus und kann für die Analyse von nicht zielgerichteten Verbindungen in komplexen chinesischen Arzneimitteln verwendet werden. Diese Studie analysierte RCE und identifizierte 1245 Verbindungen durch Vergleich mit der Datenbank, darunter 263 Verbindungen im Negativ-Ionen-Modus und 982 Verbindungen im Positiv-Ionen-Modus. Die wichtigsten Lösungsmittel für die Extraktion der Wirkstoffe von Rhodiola rosea sind Ethanol und Wasser. Im Vergleich zu reinem Wasser lassen sich mit wässrigen Lösungen organischer Lösungsmittel mehr Verbindungen extrahieren. Der Gehalt an Gallussäure im wässrigen Extrakt ist höher als der im Alkoholextrakt, während der Gehalt an Tyrosol, Chlorogensäure und Tanninen niedriger ist als der im wässrigen Alkoholextrakt. Um mehr Verbindungen zu extrahieren, wurde daher in diesem Experiment 50% Ethanol als Lösungsmittel für die Vorbereitung der RCE-Extraktion verwendet. Aufgrund des einzigen Extraktionslösungsmittels sind die nachgewiesenen Verbindungen jedoch nicht unbedingt alle Verbindungen von Rhodiola rosea, und es gibt immer noch einige Verbindungen, die nicht extrahiert oder identifiziert werden können. Daher sind weitere vergleichende Experimente mit verschiedenen Extraktionslösungsmitteln erforderlich. Die Untersuchungen von Zakharenko zeigen, dass die wichtigsten Wirkstoffe in Rhodiola rosea Salidrosid, Luteolin, Catechin, Quercetin, Kräuterextrakt und Catechin sind. Dies stimmt mit den Ergebnissen dieser Studie überein, denn RCE enthält hohe Mengen an Luteolin und Quercetin. Molekulares Docking kann vorhersagen, ob Liganden kleiner Moleküle an Rezeptorproteine binden können und welche Bindungskräfte dabei wirken. In dieser Studie wurden 20 Verbindungen mit hohem Gehalt, die aus der UHPLC-QE-MS gewonnen wurden, an die α-Glucosidase angedockt. Die Ergebnisse zeigten, dass 11 Verbindungen an α-Glucosidase binden konnten, darunter Luteolin, Salidrosid, Kaempferol, (-) - Epicatechin 3-O-Gallat, Kaffeesäure, L-Äpfelsäure, (+) - Epicatechin, Quercetin, (-) - Erythrothroanetholglykol-1-glucosid, 3-Hydroxy-4,6-heptyne-1-yl-1-glucosid und Tyrosol. Unter ihnen bildete Kaffeesäure die meisten Wasserstoffbrückenbindungen. Sie kann an die Reste His-515, Arg-437, Glu-432 und His-348 binden. (+) - Epicatechin hat die beste Bindungsaktivität mit Asn-443 und His-515, mit der niedrigsten Bindungsenergie (-17,08 kJ/mol); das Andocken von PNPG mit α-Glucosidase ergab, dass Arg-437 und Glu-432 seine beiden Bindungsstellen sind. Kaffeesäure teilt sich die gleichen Bindungsstellen mit PNPG, Arg-437 und Glu-432, während L-Äpfelsäure, Quercetin und Tyrosol sich die gleiche Bindungsstelle mit PNPG, Arg-437, teilen. Daraus lässt sich ableiten, dass die Hemmungsarten von Kaffeesäure, L-Äpfelsäure, Quercetin und Tyrosol auf α-Glucosidase möglicherweise kompetitiv sind, während die anderen sechs Verbindungen nicht kompetitiv hemmen. Allerdings sind eine weitere Reinigung der Verbindungen und Lineweaver-Burk-Reziprok-Diagramme erforderlich, um ihre Hemmungsarten zu bestimmen.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass in dieser Studie die hemmende Wirkung von RCE auf α-Glucosidase durch Enzymhemmungskinetik, UHPLCQE-MS und molekulare Docking-Techniken sichtbar gemacht wurde. Die Hemmungsart war eine gemischte Art von kompetitiver und nicht kompetitiver Hemmung, und die Bindungsaktivität zwischen (+) - Epicatechin und α - Glucosidase war die beste in RCE. Dieser Artikel liefert Grundlagenforschung für die Entwicklung von RCE als natürlicher Alpha-Glucosidase-Inhibitor und die Nutzung von Rhodiola-Ressourcen.