На основе молекулярного докинга и кинетики ингибирования фермента исследована ингибирующая активность α-глюкозидазы in vitro, выделенной из родиолы розовой. Диабет является распространенным заболеванием, которое можно разделить на два типа: диабет 1 типа (T1DM) и диабет 2 типа (T2DM). На долю T2DM приходится более 90% больных диабетом, в основном вызванным повышением постпрандиального уровня глюкозы в крови из-за инсулинорезистентности и аномальной секреции инсулина. Альфа-глюкозидаза является одним из основных ферментов, вызывающих постпрандиальную гипергликемию, и ингибирование активности альфа-глюкозидазы стало основным способом контроля постпрандиальной гипергликемии и лечения T2DM. В настоящее время в клинической практике широко используются такие ингибиторы альфа-глюкозидазы, как акарбоза, миглитол и др. Хотя они обладают высокой ингибирующей активностью, они дороги и склонны к ряду желудочно-кишечных реакций, таких как несварение желудка. Натуральные продукты, получаемые из растений, стали высококачественными источниками терапевтических средств благодаря своей низкой токсичности и побочным эффектам. Поэтому поиск безопасных и не вызывающих побочных реакций ингибиторов альфа-глюкозидазы из натуральных активных веществ стал актуальным направлением исследований.

Родиола сахалинская (Rhodiola sachalinensis), являясь одним из традиционных китайских лекарственных средств с гомологией пищевых продуктов и лекарств, содержит салидрозид, катехин, тирозол и другие активные ингредиенты. В настоящее время исследования в стране и за рубежом в основном направлены на борьбу с гипоксией, апоптозом, противоопухолевым действием, снятием стрессовых повреждений и т.д. Некоторые исследования также показывают, что он играет определенную роль в моделях диабета у грызунов и может облегчить гипергликемию, гиперлипидемию и симптомы сахара в моче у мышей с диабетом путем активации 5 '- аденозинмонофосфат-зависимой протеинкиназы (AMPK), связанных с сигнальными путями. Недавно исследователи обнаружили, что экстракт родиолы может значительно снизить постпрандиальный уровень глюкозы в крови у мышей, а его активные ингредиенты проявляют определенную степень ингибирующего действия in vitro, но конкретный механизм ингибирования не ясен. Предварительные исследования нашей команды показали, что полифенольные вещества родиолы розовой обладают определенной ингибирующей активностью в отношении альфа-глюкозидазы in vitro. Исходя из вышеизложенного, данное исследование объединяет кинетику ингибирования фермента, UHPLC-QE-MS и технологию молекулярного докинга для изучения ингибирующего эффекта экстракта родиолы розовой на альфа-глюкозидазу в визуализированной манере. Цель исследования - предоставить теоретическую базу для разработки гипогликемических препаратов и продуктов здорового питания, чтобы способствовать дальнейшему развитию и использованию родиолы розовой.

 

 

Альфа-глюкозидаза существует в щеточной кайме слизистой оболочки тонкой кишки, которая может расщеплять олигосахариды или дисахариды до моносахаридов. Ингибирование ее активности может замедлить гидролиз углеводов и скорость образования глюкозы, тем самым снижая всасывание глюкозы тонким кишечником и постпрандиальный уровень глюкозы в крови. Исследования показывают, что экстракты различных растений, таких как звездчатое яблоко, банан "слоновья нога", черная волчья ягода, шизандра китайская, пурпурный ямс и одуванчик гуйчжоуский, обладают ингибирующей активностью в отношении альфа-глюкозидазы. Полумаксимальная ингибирующая концентрация (IC50) может быть использована для оценки ингибирующего действия ингибиторов на ферменты. Чем меньше IC50, тем выше ингибирующая активность. Предыдущие исследования команды показали, что полифенолы родиолы обладают хорошим ингибирующим действием на альфа-глюкозидазу с IC50 2,83 мг/мл. IC50 RCE, полученная в этом эксперименте, составляет 1,538 мг/мл, что не только ниже, чем у акарбозы, но и ниже, чем у полифенолов родиолы. Это может быть связано с наличием в составе RCE флавоноидов, органических кислот и других веществ. Типы ингибирования ферментов ингибиторами можно разделить на обратимое ингибирование и необратимое ингибирование. РЗЭ и α-глюкозидаза, полученные в данном исследовании, относятся к обратимому ингибированию, характеризующемуся нековалентным связыванием ингибитора с ферментом, что позволяет восстановить активность фермента физическими методами. Обратимые типы ингибирования можно разделить на четыре категории: конкурентное ингибирование, неконкурентное ингибирование, антиконкурентное ингибирование и смешанное ингибирование. К смешанным типам ингибирования относятся конкурентное и неконкурентное смешанное ингибирование. Характерной особенностью этого типа является то, что увеличение концентрации ингибитора приводит к снижению максимальной скорости реакции (Vmax) ферментативной реакции и увеличению константы Михаэлиса (Km). Это исследование показывает, что увеличение концентрации RCE приводит к снижению Vmax Увеличение Km согласуется с вышеуказанными характеристиками, поэтому тип ингибирования RCE на α-глюкозидазу определяется как смешанный тип конкурентного и неконкурентного ингибирования, что указывает на то, что экстракт родиолы является эффективным природным ингибитором α-глюкозидазы. RCE согласуется с типами ингибирования α - глюкозидазы полифенолами из Rhodiola rosea, полисахаридами из Schisandra chinensis и полисахаридами из Scenedesmus macrophylla. Однако необходимо уточнить, какие соединения относятся к конкурентному ингибированию, а какие - к неконкурентному, и провести дальнейшие исследования. RCE обладает хорошей ингибирующей активностью в отношении α-глюкозидазы, но для проверки того, насколько значителен эффект в естественных условиях, необходимы дополнительные животные модели. В настоящее время существует множество источников альфа-глюкозидазы, в основном это пивные дрожжи, Aspergillus niger, термофильные Bacillus subtilis и Leuconostoc enterica. Свойства α-глюкозидазы из разных источников сильно различаются, а α-глюкозидаза, использованная в данном исследовании, получена из пивных дрожжей. Поэтому необходимы дальнейшие исследования, чтобы определить, оказывает ли RCE такое же ингибирующее действие на ферменты из других источников.
UHPLC-QE-MS обладает такими характеристиками, как скорость и точность, и может быть использован для нецелевого анализа соединений в сложных китайских лекарственных материалах. В данном исследовании был проведен анализ RCE, в результате которого было идентифицировано 1245 соединений путем сравнения с базой данных, включая 263 соединения в режиме отрицательных ионов и 982 соединения в режиме положительных ионов. Основными растворителями для извлечения активных ингредиентов родиолы розовой являются этанол и вода. По сравнению с чистой водой, водные растворы органических растворителей позволяют извлечь больше соединений. Содержание галловой кислоты в водном экстракте выше, чем в спиртовом, а содержание тирозола, хлорогеновой кислоты и дубильных веществ ниже, чем в водно-спиртовом экстракте. Поэтому, чтобы извлечь больше соединений, в данном эксперименте в качестве растворителя для приготовления экстракта RCE использовался этанол 50%. Однако из-за использования одного растворителя обнаруженные соединения не обязательно являются всеми соединениями родиолы розовой, и некоторые соединения все еще не могут быть извлечены или идентифицированы. Поэтому необходимы дальнейшие сравнительные эксперименты с различными экстракционными растворителями. Исследование Захаренко показывает, что основными действующими веществами родиолы розовой являются салидрозид, лютеолин, катехин, кверцетин, экстракт травы и катехин. Это согласуется с результатами данного исследования, поскольку RCE содержит высокий уровень лютеолина и кверцетина. Молекулярный докинг позволяет предсказать, могут ли лиганды малых молекул связываться с рецепторными белками, и каковы силы связывания. В этом исследовании 20 соединений с высоким содержанием, полученных с помощью UHPLC-QE-MS, были состыкованы с α-глюкозидазой. Результаты показали, что 11 соединений могут связываться с α-глюкозидазой, включая лютеолин, салидрозид, каэмпферол, (-) - эпикатехин 3-O-галлат, кофейную кислоту, L-малиновую кислоту, (+) - эпикатехин, кверцетин, (-) - эритротро-анетол гликоль 1-глюкозид, 3-гидрокси-4,6-гептин-1-ил 1-глюкозид и тирозол. Среди них наибольшее количество водородных связей образовала кофейная кислота. Она может связываться с остатками His-515, Arg-437, Glu-432 и His-348. (+) - Эпикатехин обладает наилучшей активностью связывания с Asn-443 и His-515, с самой низкой энергией связывания (-17,08 кДж/моль); докинг PNPG с α-глюкозидазой показал, что Arg-437 и Glu-432 являются его двумя сайтами связывания. Кофейная кислота имеет одинаковые сайты связывания с PNPG, Arg-437 и Glu-432, в то время как L-малиновая кислота, кверцетин и тирозол имеют одинаковый сайт связывания с PNPG, Arg-437. Таким образом, можно предположить, что кофейная кислота, L-малиновая кислота, кверцетин и тирозол ингибируют α-глюкозидазу конкурентно, в то время как остальные шесть соединений ингибируют не конкурентно. Однако для определения типов ингибирования необходима дальнейшая очистка соединений и взаимные графики Лайнуивера-Бурка.
Таким образом, в данном исследовании было изучено ингибирующее действие RCE на α-глюкозидазу с помощью кинетики ингибирования фермента, UHPLCQE-MS и методов молекулярного докинга. Тип ингибирования представлял собой смешанный тип конкурентного и неконкурентного ингибирования, а активность связывания между (+) - эпикатехином и α - глюкозидазой была наилучшей в RCE. Данная статья представляет собой фундаментальное исследование для разработки RCE в качестве природного ингибитора альфа-глюкозидазы и использования ресурсов родиолы.