Анализ состава и различий эндофитных бактериальных сообществ в различных состояниях покоя семян цяньхуа
Notopterygium incisum Ting ex H. T. Chang - вид растений семейства Зонтичные (Umbelliferae). Его высушенные корневища используются в качестве лекарственного средства и широко применяются в традиционной китайской и тибетской медицине, широко известной как черная медицина. Он пользуется большим спросом на рынке. В настоящее время Цяньхуо в основном происходит из диких ресурсов и распространен в основном в кустарниковых лугах на высоте 3000-4500 м над уровнем моря в Сычуани, Ганьсу, Цинхае и других местах. В последние годы чрезмерные земляные работы нанесли большой ущерб экологической обстановке, и живые ресурсы дикого цяна приближаются к истощению. Поэтому срочно требуется искусственное одомашнивание и культивирование.
Когда семена Цяньхуо созревают и высаживаются, развитие зародыша происходит неполно, и часто зародыш отсутствует или наблюдается явление примитивного зародыша. Он обладает двойным свойством покоя - морфологическим и физиологическим, и относится к семенам глубокого покоя. Всхожесть семян Цяньхуо в естественных условиях крайне низкая (0,52%). В настоящее время эффективным методом снятия спячки семян Цяньхуо является метод ГА+переменная температура хранения в песке. Сначала используется метод хранения в песке при теплой температуре для снятия морфологической спячки, а затем требуется обработка при низкотемпературном хранении в песке для снятия физиологической спячки, прежде чем семена обретут способность прорастать. Время обработки семян может длиться более 8 месяцев. При использовании этого метода обработки семян Qianghuo, самый высокий уровень всхожести составляет 21,2%. Кроме того, цикл роста лекарственных трав Цяньхуо составляет более 4 лет, и из-за длительного инвестиционного цикла и низкой эффективности развитие искусственного культивирования идет очень медленно. В настоящее время существует лишь спорадическое культивирование, которое не может удовлетворить потребности рынка Цяньхуо в устойчивом развитии. Технология ручного освобождения семян Цяньхуо от спячки не достигла прорывного прогресса за последнее десятилетие, что является одной из основных проблем, ограничивающих крупномасштабное выращивание Цяньхуо.
Эндофитные бактерии в растениях - это грибы или бактерии, которые живут в различных тканях и органах здоровых растений на определенных или всех стадиях их жизненного цикла. Они формируют сложные и особые мутуалистические отношения с растением-хозяином при длительном сосуществовании и способствуют делению клеток, развитию корней и росту проростков, повышая метаболизм ауксина и митогенов в растении. Дремота семян контролируется балансом между стимуляторами роста гиббереллином и ингибиторами роста абсцизовой кислотой. Исследования показали, что эндофитные бактерии могут регулировать состояние покоя семян, регулируя или индуцируя синтез эндогенных гормонов в растениях, что создает теоретическую основу для изучения ресурсов эндофитных бактерий с функциями стимулирования роста семян. Pu Fengya и др. обнаружили, что эндофитные бактерии в слезах Иова могут увеличить скорость прорастания слез Иова, риса и семян пшеницы, а также способствовать росту проростков, индуцируя рост корней. Лэй Руйфэн обнаружил, что эндофитные бактерии в семенах серебристой саранчи способствуют прорастанию семян, регулируя метаболизм семян. Xiang Yiqing и другие обнаружили, что эндофитные бактерии в семенах Huanglian могут значительно улучшить скорость прорастания семян Huanglian. Эндофитные бактерии сычуаньского перца (Capsicum annuum), риса (Oryza sativa L.) и Dendrobium catenatum непосредственно способствуют росту и развитию растений-хозяев, выделяя эндогенные гормоны, такие как ауксин, абсцизовая кислота, цитокинин, гибберелловая кислота и др. Эндофитные бактерии, выделенные из семян Achnatherum inebrians, Dendrobium nobile и Lolium rigidum, а также эндофитные бактерии, выделенные из корней Polygonatum multiflorum L., регулируют состояние покоя семян, выделяя эндогенные гормоны, такие как цитокинин, значительно улучшая их прорастание и выживаемость. Однако могут ли эндофитные бактерии в семенах Qianghuo способствовать выходу из состояния покоя, стимулируя рост зародыша? Исходя из этого, в данном эксперименте в качестве объекта исследования взяты семена Цяньхуо, и с помощью технологии высокопроизводительного секвенирования Illumina MiSeq culture free изучены состав и различия эндофитных бактериальных сообществ в различных состояниях покоя семян Цяньхуо. Это создает теоретическую основу для дальнейших исследований по использованию микроорганизмов для снятия состояния покоя семян Цяньхуо, а также дает важные теоретические рекомендации для выращивания растений с аналогичными характеристиками покоя.

Являясь важным репродуктивным органом растений, семена могут служить средой для передачи полезных микроорганизмов от материнских растений к следующему поколению посредством вертикального размножения, тем самым способствуя прорастанию семян и росту рассады. Эндофитные бактерии в семенах таких трав, как рис и кукуруза, играют важную роль в прорастании семян, росте и развитии проростков, а также в росте растения-хозяина. Семена Dendrobium nobile Lindl. характеризуются постсозреванием и лишены ткани эндосперма, поэтому для их прорастания необходим симбиоз с микроорганизмами. Доминирующими эндофитными бактериями являются в основном протеобактерии и цианобактерии. Данное исследование показало, что семена Цяньхуо находятся в трех различных состояниях покоя, а типы эндофитных бактериальных сообществ схожи на уровне филумов. Эндофитные бактерии в основном состоят из Proteobacteria, Actinobacteria и Firmicutes, что соответствует доминирующим эндофитным бактериальным филам других семян растений. Однако, по сравнению с семенами Dendrobium officinale, доминирующая фила эндофитных бактерий имеет различия. Типы растительных секретов и способность микроорганизмов колонизировать, выживать и распространяться в семенах различны, что приводит к различиям в эндофитных бактериях в семенах разных растений. Поскольку эндофитные бактерии в семенах происходят из различных органов растений или меристематических тканей, они переносятся и колонизируют зародыш и эндосперм семени через микротрубочки или гаметы и распространяются вертикально. Семена лекарственных растений Qianghuo и Dendrobium officinale с трудом прорастают из-за своих свойств покоя. Однако исследования показали, что доминирующие эндофитные бактериальные филы этих двух растений имеют различия, что может быть связано с их разными источниками эндофитных бактерий. Семена Qianghuo находятся в состоянии покоя из-за неполного развития зародыша, и их эндофитные бактерии в основном поступают из эндосперма, в то время как семена Dendrobium officinale находятся в состоянии покоя из-за отсутствия эндосперма. Их эндофитные бактерии в основном происходят из зародыша, поэтому между ними существуют различия в типах филумов. Предполагается, что семенам Qianghuo также необходимо сосуществовать с микроорганизмами для прорастания. Небольшое количество эндофитных бактерий, принадлежащих к филуму Bacteroidetes (2,01%), появилось в семенах Цяньхуо в состоянии GSC, в то время как неизвестные эндофитные грибы, принадлежащие к филуму Bacteroidetes, появились в 24,33% и 7,74% семян в состояниях GSB и GSC, соответственно. Эти эндофитные бактерии могут играть важную роль в стимулировании роста зародыша семени и освобождении семян от спячки и станут предметом будущих исследований. Эндофитные грибы имеют высокую численность и разнообразие в семенах многих растений. Эндофитные грибы в семенах Qianghuo в основном состоят из Ascomycota и Basidiomycota, что соответствует доминирующим эндофитным грибам в семенах Phaseolus vulgaris L. и Dendrobium nobile.

На уровне рода состав эндофитных бактериальных сообществ меняется от GSA к GSB, а типы эндофитных бактериальных сообществ схожи от GSB к GSC. С помощью анализа разнообразия по методу Альфа было установлено, что разнообразие эндофитных бактерий в GSA было значительно ниже, чем в GSB и GSC, в то время как между GSB и GSC не было значительной разницы в разнообразии эндофитных бактерий. Основная причина может заключаться в том, что в состоянии GSA филум Proteobacteria имел абсолютное преимущество, составляя 97,08%, и тем самым подавлял рост других бактерий. В отличие от этого, семена в состояниях GSB и GSC долгое время находились в относительно гипоксической среде, что привело к относительно меньшей конкуренции между микроорганизмами и отсутствию значительного ингибирующего эффекта между микроорганизмами, что привело к более высокому индексу разнообразия, чем в состоянии GSA. Не было отмечено существенной разницы в разнообразии сообществ эндофитных грибов в течение всего процесса освобождения семян от спячки. Посредством бета-анализа разнообразия PCoA было установлено, что структура сообщества эндофитных бактерий претерпела значительные изменения от GSA к GSB и затем к состоянию GSC, в то время как структура сообщества эндофитных грибов не претерпела значительных изменений от GSA к GSB до момента освобождения семян от физиологической спячки. Семена Цяньхуо созревают и оседают на землю, а способность к прорастанию появляется только после длительной тепловой и низкотемпературной стратификационной обработки. В этот период меняется структура сообщества эндофитных бактерий в семенах, что указывает на то, что это один из основных факторов, влияющих на способность семян Цяньхуо к прорастанию, и механизм его действия требует дальнейшего изучения.
Роль эндофитных бактерий в семенах растений не выяснена, но большое количество исследований показало, что эндофитные бактерии оказывают регулирующее воздействие на растения-хозяева и семена. Эндофитные бактерии в райграсе могут вырабатывать цитокинины и взаимодействовать с растительными гормонами, вырабатываемыми растением, тем самым регулируя состояние покоя семян. Эндофитные бактерии в семенах также могут способствовать росту растений, вырабатывая растительные гормоны или способствуя поглощению питательных веществ, особенно азота и фосфора. В данном исследовании был проведен дальнейший анализ характерных микроорганизмов GSA, GSB и GSC на уровне рода. Всего было обнаружено 15 эндофитных бактерий и ни одного характерного микроорганизма в эндофитных грибах. Эти микроорганизмы были относительно многочисленны на соответствующих стадиях покоя по сравнению с другими стадиями покоя и могут играть важную роль в освобождении морфологической и физиологической спячки семян цяньфу, что делает их ключевой микробной популяцией для будущих исследований. Среди них доминирующими родами бактерий в статусе GSA являются Erwinia и Pseudomonas. Pseudomonas участвует в процессе порчи многих фруктов и овощей, причем от 50% до 90% порченых бактерий являются Pseudomonas. Пектиновая кислотная лиаза и фермент метилгалактуронат пектина, выделяемые Erwinia, оказывают синергетическое действие на размягчение растительных тканей, что может разрушать пектин на клеточной стенке растений и вызывать их размягчение и порчу. Результаты этого исследования показывают, что свежесобранные семена цяньфу необходимо своевременно хранить в песке, чтобы предотвратить порчу и повлиять на прорастание семян. Хуан Чжиюань и др. обнаружили, что относительная численность представителей рода Erwinia в побегах бамбука Phyllostachys nuda уменьшалась с повышением температуры хранения во время хранения. В данном исследовании было обнаружено, что количество свежесобранных семян цяньфу значительно уменьшилось после обработки теплой температурой (15 ℃), что согласуется с результатами предыдущих исследований. Это может быть связано с тем, что эндосперм семян подвергался теплой температуре и обработке песком при хранении, а доминирующие бактерии, разлагавшие эндосперм, производили большое количество энергии для развития эмбрионов, косвенно сдерживая их рост. Когда семена Цяньхуо созревают и выходят на поверхность, зародыш еще не развивается, и его необходимо хранить в теплом песке до 8 месяцев, чтобы снять морфологическую спячку, что связано с наличием в эндосперме трудноразлагаемых ингибиторов прорастания. Род красных плавательных бактерий обладает способностью к денитрификации и является функциональной бактерией, способной разлагать органические вещества и некоторые азотсодержащие соединения, которые трудно поддаются биодеградации. Данное исследование показало, что в состоянии GSB доминирующими эндофитными бактериями являются род красных плавающих бактерий и род Catellatospora, которые могут играть роль в деградации ингибиторов прорастания и стимулировании роста зародыша, и являются ключевыми группами микроорганизмов для будущих исследований. Доминирующими бактериальными родами в статусе GSC являются роды Deinococcus, Steridobacterium, Rhizobium, Mucococcus, Mycobacterium, Hydrobacteria, Micromonospora, Actinobacteria, Bacillus, Flavobacterium и Myceticola. Исследования показали, что род Dvoras является азотфиксирующей бактерией; медленно растущие ризобии обладают способностью растворять неорганические фосфаты, что может увеличить содержание пигментов при фотосинтезе растений; штамм Mycetocola был первоначально обнаружен на леднике Ми Дуй и является холодостойким микроорганизмом. После выхода из состояния покоя при хранении в теплом песке семена Qianghuo не способны прорастать. Для прорастания их необходимо подвергнуть низкотемпературному хранению в песке. Предполагается, что после выхода из состояния покоя эндосперм будет истощен и не сможет обеспечить энергию, необходимую для дальнейшего роста зародыша и зародышевого корня. Азотные продукты, образующиеся в результате деградации азотсодержащих ингибиторов прорастания красными подвижными микроорганизмами, накопленные на стадии выхода из состояния покоя, не могут быть непосредственно поглощены зародышем. Они должны быть преобразованы в азот, который может быть поглощен растением с помощью азотфиксирующих микроорганизмов, чтобы способствовать росту зародыша и прорыву зародышевого корня через семенную оболочку. Предполагается, что для нормального роста азотфиксирующие микроорганизмы должны сотрудничать с микроорганизмами Myceticola, а микроорганизмы Myceticola могут нормально расти только в низкотемпературной среде. Поэтому семена Цяньхуо должны пройти период времени после выхода из состояния покоя. Только после низкотемпературной обработки зародышевый корень пробивается сквозь оболочку семени, и семена приобретают способность к прорастанию. Предполагается, что характерные микроорганизмы медленно растущих ризобий в эмбрионах в состоянии GSC могут увеличивать содержание фотосинтетических пигментов в эмбрионах, подготавливая их к фотосинтезу в эмбрионах.
Из-за того, что семена Цяньхуа созревают и высаживаются в виде прототипов зародышей или без зародышей, рост зародышей семян при искусственном выращивании происходит очень медленно, что приводит к длительному времени прорастания и затрудняет процесс прорастания семян Цяньхуа. В естественном состоянии для прорастания требуется до 11 месяцев. Необходимо срочно найти микроорганизмы, способствующие росту зародышей семян, чтобы освободить их от морфологической и физиологической спячки, обеспечив мощную поддержку для развития искусственного выращивания Цяньхуо. В данном эксперименте было проведено углубленное исследование состава структуры сообщества и различий эндофитных бактерий и грибов в различных состояниях покоя семян Цяньфу с помощью методов высокопроизводительного секвенирования без культивирования. Были проанализированы характерные микроорганизмы для каждого состояния покоя. Данная работа предлагает новую идею использования микробных методов для снятия состояния покоя семян Цяньфу, заполняет пробел в области исследований микробного содействия снятию состояния покоя семян и закладывает основу для дальнейшего использования этих потенциальных эндофитных бактериальных ресурсов с эффектом содействия снятию состояния покоя для улучшения всхожести семян Цяньфу и содействия их стандартизированному развитию при искусственном выращивании. Предполагается, что эта статья станет теоретическим руководством для использования микробных методов, таких как инженерные штаммы или микробные препараты для быстрого снятия спячки семян.