Исследование химических компонентов с ингибирующей активностью HDAC в Epimedium sagittatum
В эукариотических клетках гистоновые деацетилазы (HDAC) восстанавливают положительный заряд гистонов, удаляя ацетильные группы с остатков лизина в сердцевине гистона, тем самым прочно связываясь с отрицательно заряженной ДНК, образуя структурно плотный хроматин и подавляя транскрипцию определенных генов. Аномальная активация HDACs тесно связана с такими заболеваниями, как опухолевый генез и аномальное развитие тканей. Разработанные ингибиторы гистондеацетилазы (HDACi) нашли применение в клинической практике. Например, SAHA и Romidpesion стали терапевтическими препаратами для лечения опухолей кожи и периферических лимфоцитарных опухолей. Ингибиторы HDAC имеют разнообразную структуру, включая короткоцепочечные жирные кислоты, такие как масляная кислота и трихостатин А, циклические пептиды, а также флавоноиды, такие как генистеин и каэмпферол, что делает их актуальной темой для поиска новых лекарств. Эпимедиум - это традиционное китайское лекарственное средство, которое тонизирует почки и кости, укрепляет мышцы и кости, противостоит ревматизму, улучшает работу печени и почек; фармакологические исследования выявили влияние травы эпимедиума на усиление сексуальной функции, регулирование гормонов, модулирование иммунитета, а также профилактику и лечение остеопороза. Трава эпимедиума содержит более 140 различных типов флавоноидов, однако существует мало исследований, посвященных активным ингредиентам эпимедиума против остеопороза, основанным на механизме ингибирования HDAC. В данной статье представлены результаты нашего исследования и идентификации ингибирующих HDAC активных ингредиентов в Epimedium sagittatum под руководством отслеживания активности.
В ходе этого эксперимента было установлено, что участок растворителя с сильным ингибированием активности HDAC этанольным экстрактом 70% Epimedium sagittatum - это участок этилацетата, который был обработан макропористой адсорбционной смолой D101. Продукты элюирования этанола 40% и 60% представляли собой активные участки ингибирования HDAC (см. рис. 1). Одиннадцать соединений были идентифицированы путем колоночного хроматографического разделения и спектрального анализа, ориентируясь на активность. Среди них неизопентеновые замещенные флавоноидные гликозиды (Соединение 1) и флавоноидные гликозиды (Соединения 2-10) показали более сильную ингибирующую HDAC активность, чем икариин, что указывает на то, что эти компоненты являются основными действующими веществами в ингибировании HDAC активности в этом растении. Среди 9 выделенных флавоноидных гликозидов 6 оказались каэмпферол-3-O-глюкозидами, включая соединение 5 с высоким выходом (каэмпферол-3-O-β - D-глюкопиранозид), что указывает на то, что каэмпферол-3-O-глюкозид обладает относительно сильной ингибирующей HDAC активностью. Соединения с более низкой активностью - 7 и 8. Из-за этерификации одной или двух гидроксильных групп на сахарной группе кумаровой кислотой, HDAC-ингибирующая активность 7 и 8 ниже, чем у изорамнетин-3-О-глюкозида (9 и 10), что указывает на то, что этерификация кумаровой кислоты на сахарной группе каэмпферол-3-О-глюкозида может ослабить HDAC-ингибирующую активность (см. табл. 3). Однако, поскольку набор для скрининга ингибиторов HDAC содержит HDAC, выделенный из ядра клеток HeLa, которые представляют собой смесь, содержащую различные подтипы HDAC, необходимы дальнейшие исследования, чтобы определить, какая одна или несколько активностей (функций) HDAC ингибируется флавоноидами, содержащимися в Epimedium sagittatum.
Как уже упоминалось ранее, ингибирование HDAC может быть достигнуто путем регулирования его экспрессии в клетках. Наше исследование с использованием клеток HeLa показало (как показано на рис. 2), что каэмпферол-3-O-альфа-L-актанопиранозид (3), каэмпферол-3-O-бета-D-ксилопиранозид (4) и каэмпферол-3-O-бета-D-глюкопиранозид (5) не оказывали существенного влияния на экспрессию HDACs I типа, но могли значительно ингибировать HDAC6 в HDACs II типа (соединения 3 и 4). 5) и HDAC10 (соединения 4 и 5) являются недавно обнаруженными флавоноидными ингибиторами экспрессии белка HDAC; среди них 4 одновременно ингибируют экспрессию белка других HDAC II (HDAC4-7) и IV (HDAC9-11) классов, и их эффекты заслуживают дальнейшего изучения.
HDAC играет важную роль в регуляции клеточной транскрипции, прогрессии клеточного цикла, росте и развитии, деацетилируя основные гистоны для подавления транскрипции определенных генов. Селективные HDACi могут воздействовать на сверхэкспрессированные HDACs, позволяя подавленным генам нормально экспрессироваться, что играет роль в лечении таких заболеваний, как опухоли, артрит и дисплазия тканей. Например, HDAC1-2 (тип I) опосредует восстановление повреждений ДНК и высоко экспрессируется в различных раковых тканях, таких как рак легких и рак желудка. Во время лучевой терапии опухолей одновременное применение ингибиторов HDAC1-2 может предотвратить восстановление ДНК опухолевых клеток и способствовать апоптозу раковых клеток. Аномальная экспрессия HDAC8 (тип I) и HDAC10 (тип II) является отличительной чертой прогрессирования и злокачественности нейробластомы. Ингибитор HDAC6-8-10 TH34 может вызывать апоптоз опухолевых клеток, прерывание митоза и остановку клеточного цикла, что приводит к гибели опухолевых клеток; комбинация TH34 и ретиноевой кислоты может дать синергетический эффект. Повышение экспрессии HDAC4-6-7 (тип II) приводит к снижению уровня ключевых транскрипционных факторов Runx2 и Qstelix во время дифференцировки остеобластов, что неблагоприятно для формирования остеобластов; повышение экспрессии гена и белка HDAC6 может также вызывать деформацию и укорочение примитивных ресничек в остеобластах, что приводит к уменьшению количества реснитчатых клеток, тем самым подавляя функцию ALP остеобластов и эффективно препятствуя остеогенному созреванию, индуцированному костным морфогенетическим белком (BMP). Ингибирование экспрессии или функции HDAC6 и HDAC4 способствует дифференцировке остеобластов и формированию костной ткани, защищая плотность кости.
Данные этого исследования впервые показывают, что каэмпферол-3-О-глюкозид (соединения 3, 4 и 5) в Epimedium sagittatum обладает явным HDAC-ингибиторным действием, а их ингибирующее воздействие на экспрессию белка HDAC6 дает экспериментальные основания для идентификации его как потенциального противоостеопорозного и противоопухолевого активного ингредиента со структурными характеристиками каэмпферол-3-О-глюкозида в траве Epimedium.