Исследование активности и механизма действия RCE-4, активного ингредиента травы лука, в ингибировании пролиферации, инвазии и миграции клеток Ca Ski в раке шейки матки
Рак шейки матки - распространенная гинекологическая злокачественная опухоль, и в настоящее время основными методами лечения этого заболевания в клинической практике являются хирургия, лучевая терапия и химиотерапия. Однако из-за того, что рак шейки матки в большинстве случаев является инвазивной опухолью, характеризующейся легким метастазированием и распространением, он часто приводит к плохим результатам лечения. Поэтому поиск новых химиотерапевтических препаратов против рака шейки матки, способных ингибировать его инвазию и миграцию, привлекает большое внимание. Препараты из природных источников всегда высоко ценились учеными благодаря их многоцелевому действию, эффективности и низкой токсичности. RCE-4 - это спиростановый сапонин, выделенный в нашей лаборатории из Reineckia carnea (Andr.) Kunth, растения семейства Liliaceae. Его химическое название - (1 β, 3 β, 5 β, 25S) - спиростан-1,3-диол1- [α - L-рамноза - (1 → 2) - β - D-ксилопиранозид. Его структура представлена на рисунке 1, и он имеет самое высокое содержание (до 13%) среди всех сапонинов Reineckia carnea (Andr.) Kunth. В то же время его фармакологическая активность также является наилучшей. RCE-4 был включен в местные стандарты китайской травяной медицины провинции Хубэй в качестве важного компонента Reineckia carnea.
Предыдущие исследования в нашей лаборатории показали, что RCE-4 обладает хорошей селективной цитотоксичностью против клеток рака шейки матки Ca Ski и может значительно подавлять рост опухолей при трансплантации клеток Ca Ski мышам nude. Наибольшая степень ингибирования опухоли может достигать 69,1%. Метастазирование, инфильтрация и патологические изменения опухолевых клеток в таких важных тканях, как матка и яичники, у обработанных мышей не наблюдались. Основываясь на предыдущих результатах, мы предполагаем, что RCE-4 может оказывать ингибирующее действие на инвазию и миграцию клеток рака шейки матки. В настоящее время нет сообщений о его сопутствующей активности и молекулярных механизмах действия.
Wnt/β - катенин и Hippo/YAP - два внутриклеточных сигнальных пути, тесно связанных с инвазией и миграцией опухолей. Оба пути регулируют инвазию и миграцию опухолей, проникая в ядро через свои основные сигнальные молекулы (β - катенин и YAP/TAZ) и связываясь с транскрипционными факторами для транскрипции нижележащих генов-мишеней. Блокирование пути Wnt/β - катенин оказывает значительное ингибирующее действие на пролиферацию опухоли. Аномальная активация сигнального пути Wnt/β - катенин может вызывать дефекты роста и развития, а также возникновение, миграцию и инвазию опухолей. Снижение регуляции нижележащих белков, таких как MMP2 и MMP9, на пути Wnt/β - катенин может препятствовать метастазированию опухолевых клеток. В отличие от биологической функции Wnt/β - катенинового пути, активация Hippo/YAP-пути подавляет пролиферацию клеток и способствует их апоптозу. В отсутствие активирующих факторов, связанных с Hippo, нефосфорилированный YAP переносится в ядро и взаимодействует с фактором активации транскрипции семейства TEAD/TEF, регулируя экспрессию генов-мишеней. Внеклеточные стимулирующие сигналы могут активировать Mst1/2 через неясный механизм, а затем фосфорилировать другие члены ядра через серию каскадных реакций фосфорилирования.
Поэтому в данном исследовании мы сосредоточимся на клетках рака шейки матки Ca Ski и изучим эффекты и молекулярные механизмы воздействия RCE-4 на пролиферацию, инвазию и миграцию рака шейки матки через сигнальные пути Wnt/β - катенин и Hippo/YAP, обеспечивая теоретическую поддержку для будущего клинического применения RCE-4.

В нашей лаборатории с помощью МТТ-экспериментов было показано, что RCE-4 может ингибировать пролиферацию клеток Ca Ski в зависимости от времени и дозы. Результаты эксперимента по образованию клонов в данном исследовании дополнительно подтверждают эффективность RCE-4. Кроме того, влияние RCE-4 на инвазию и миграцию клеток Ca Ski было обнаружено в экспериментах с царапинами и инвазией в камере Transwell in vitro. Результаты показали, что RCE-4 значительно подавлял миграцию и способность к инвазии клеток Ca Ski и проявлял концентрационную зависимость.
Сигнальный путь Wnt/β - катенин играет важную роль в миграции опухоли, а вход β - катенина в ядро является ключом к активации этого пути. Результаты показали, что RCE-4 может ингибировать ядерный вход β-катенина через три пути: ингибирование экспрессии p-GSK3 β, содействие фосфорилированию β-катенина и ингибирование экспрессии PAK4, тем самым подавляя транскрипцию нижележащих генов, таких как матриксные металлопротеиназы MMP2/7/9/14. Интересно, что последние исследования показали, что ингибирование активности PAK4 может синергически усиливать терапевтический эффект иммуноблокадной терапии PD-1. Терапия PD-1 малоэффективна при отсутствии предварительной инфильтрации иммунных клеток в опухолевую ткань, что также является основной причиной развития резистентности к терапии PD-1. Использование ингибиторов PAK4 может значительно усилить ответ опухолевых тканей на терапию блокадой PD-1 in vivo. Учитывая значительное ингибирующее действие RCE-4 на PAK4, это дает нам новое направление исследований.
Связь между сигнальным путем Hippo/YAP и инвазией опухолевых клеток также подтверждена, но до сих пор существует относительно мало препаратов, нацеленных на сигнальный путь Hippo/YAP. В 2018 году Гилл и др. обнаружили, что вокруг входа молекул YAP/TAZ в ядро существует особая петля положительной обратной связи, которая состоит из пяти белковых молекул: NUAK2, LATS1, p-LATS1, YAP/TAZ в цитоплазме и ядре. NUAK2 может ингибировать экспрессию LATS1, чтобы предотвратить его фосфорилирование, тем самым способствуя переносу молекул комплекса YAP/TAZ из цитоплазмы в ядро. Молекулы YAP/TAZ, попадая в ядро, связываются с транскриптами NUAK2, и транскрибированный NUAK2 попадает в цитоплазму, образуя петлю положительной обратной связи. Открытие этого цикла делает сигнальный путь Hippo/YAP более сложным и объясняет трудность регулирования сигнального пути Hippo/YAP для ингибирования инвазии опухолевых клеток. Результаты этого эксперимента показали, что RCE-4 может ингибировать ядерное проникновение YAP/TAZ через несколько путей, включая ингибирование фосфорилирования MST1, усиление фосфорилирования YAP и снижение экспрессии YAP. Уменьшение количества YAP/TAZ в ядре приводит к снижению экспрессии NUAK2, тем самым разрывая эту петлю положительной обратной связи. Нарушение цикла приводит к снижению экспрессии нижележащих белков, таких как молекула межклеточной адгезии-1 (ICAM-1), молекула адгезии сосудистых клеток-1 (VCAM-1), CYR61 и SOX2, что значительно подавляет миграционную способность клеток Ca Ski.
Стоит отметить, что сигнальные пути Wnt/β - катенин и Hippo/YAP в клетках не являются полностью несвязанными, и они взаимодействуют во многих отношениях. Например, фосфорилированный YAP/TAZ может связываться с β - катенином, заставляя его оставаться в цитоплазме и ингибируя его транскрипционную активность. YAP может вызывать инактивацию GSK3 β, которая, в свою очередь, стабилизирует цитоплазматический β - катенин и способствует ядерному переносу β - катенина. В данном исследовании еще не проводилось углубленного изучения взаимной обратной связи между двумя сигнальными путями. В то же время данный этап исследования также имеет определенные ограничения. Он не был проверен на других клеточных линиях рака шейки матки, таких как Hela и SiHa, и не имеет экспериментальных результатов на животных. Это также является нашим следующим направлением исследований.
Таким образом, RCE-4 обладает хорошей способностью ингибировать инвазию и миграцию клеток Ca Ski. Его молекулярный механизм в основном достигается за счет блокирования ключевого этапа проникновения β - катенина и YAP/TAZ в ядро, тем самым подавляя активацию сигнального пути Wnt/β - катенин и активируя сигнальный путь Hip po/YAP.