Az endofita baktériumközösségek összetételének és különbségeinek elemzése a Qianghuo vetőmagok különböző nyugalmi állapotaiban
A Notopterygium incisum Ting ex H. T. Chang az Umbelliferae családba tartozó növényfaj. Szárított rizómáit gyógyszerként használják, és a hagyományos kínai és tibeti gyógyászatban, közismert nevén a fekete gyógyászatban is gyakran alkalmazzák. Nagy piaci keresletet élvez. Jelenleg a Qianghuo főként vadon termő forrásokból származik, és főként a 3000-4500 m magasságban fekvő bozótos füves területeken terjed Szecsuánban, Gansuban, Csinghajban és más helyeken. Az elmúlt években a túlzott kitermelés nagy károkat okozott az ökológiai környezetben, és a vadon élő Qiang élő erőforrások kimerüléséhez közelednek. Ezért sürgősen szükség van a mesterséges háziasításra és termesztésre.
Amikor a Qianghuo magjai megérnek és földet érnek, az embriófejlődés nem teljes, és gyakran nincs embrió vagy primitív embriójelenség. Morfológiailag és fiziológiailag kettős nyugalmi állapot jellemzi, és a mély nyugalmi állapotú vetőmagok közé tartozik. A Qianghuo vetőmagok csírázási aránya természetes környezetben rendkívül alacsony (0,52%). A Qianghuo vetőmagok nyugalmi állapotának feloldására a jelenlegi hatékony módszer a GA+változó hőmérsékletű homokos tárolási módszer. Először a meleghőmérsékletű homoktárolási módszert alkalmazzák a morfológiai nyugalmi állapot feloldására, majd az alacsony hőmérsékletű homoktárolási kezelésre van szükség a fiziológiai nyugalmi állapot feloldásához, mielőtt a magok csírázóképesek lennének. A vetőmagkezelés ideje több mint 8 hónapig is eltarthat. Ezzel a módszerrel a Qianghuo vetőmagok kezelésére a legmagasabb csírázási arány 21,2%. Ezenkívül a Qianghuo gyógynövények növekedési ciklusa több mint 4 év, és a hosszú befektetési ciklus és a lassú hatékonyság miatt a mesterséges termesztés fejlődése nagyon lassú. Jelenleg csak szórványos termesztés áll rendelkezésre, ami nem tudja kielégíteni a Qianghuo piac fenntartható fejlődési igényeit. A Qianghuo vetőmagok nyugalmi állapotának kézi feloldására szolgáló technológia az elmúlt évtizedben nem ért el áttörő haladást, ami az egyik fő probléma, amely korlátozza a Qianghuo nagyüzemi termesztését.
A növényekben előforduló endofita baktériumok olyan gombákat vagy baktériumokat jelentenek, amelyek az egészséges növények különböző szöveteiben és szerveiben élnek életciklusuk bizonyos vagy valamennyi szakaszában. A gazdanövénnyel hosszú távú együttélésben összetett és különleges mutualista kapcsolatot alakítanak ki, és a növényben az auxin és a mitogének anyagcseréjének fokozásával elősegítik a sejtosztódást, a gyökérfejlődést és a csíranövények növekedését. A magvak nyugalmi állapotát a gibberellin növekedésserkentők és az abszcizinsav növekedésgátlók közötti egyensúly szabályozza. A kutatások megállapították, hogy az endofita baktériumok a növényekben endogén hormonok szintézisének szabályozásával vagy indukálásával szabályozhatják a magok nyugalmi állapotát, ami elméleti alapot nyújt a magokban növekedést elősegítő funkcióval rendelkező endofita baktériumforrások feltárásához. Pu Fengya és munkatársai megállapították, hogy a Jób könnyében található endofita baktériumok növelhetik a Jób könnye, a rizs és a búza magvak csírázási arányát, és a gyökérnövekedés indukálásával elősegítik a csemeték növekedését. Lei Ruifeng felfedezte, hogy az ezüsthomokos sáska magjaiban lévő endofita baktériumok a magok anyagcseréjének szabályozásával elősegítik a magok csírázását. Xiang Yiqing és mások megállapították, hogy a Huanglian magokban lévő endofita baktériumok jelentősen javíthatják a Huanglian magok csírázási arányát. A szecsuáni paprika (Capsicum annuum), a rizs (Oryza sativa L.) és a Dendrobium catenatum endofita baktériumai közvetlenül elősegítik a gazdanövények növekedését és fejlődését endogén hormonok, például auxin, abszcizinsav, citokinin, gibberellinsav stb. kiválasztásával. Az Achnatherum inebrians, a Dendrobium nobile és a Lolium rigidum magvaiból izolált endofita baktériumok, valamint a Polygonatum multiflorum L. gyökereiből izolált endofita baktériumok endogén hormonok, például citokinin kiválasztásával szabályozzák a magok nyugalmi állapotát, jelentősen javítva a csírázási és túlélési arányukat. A Qianghuo magvakban található endofita baktériumok azonban elősegíthetik-e a nyugalmi állapot feloldását azáltal, hogy elősegítik az embrió növekedését? Ennek alapján ez a kísérlet a Qianghuo vetőmagokat veszi kutatási tárgynak, és az Illumina MiSeq kultúra ingyenes nagy áteresztőképességű szekvenálási technológiát használja a Qianghuo vetőmagok különböző nyugalmi állapotaiban az endofita baktériumközösségek összetételének és különbségeinek tanulmányozására. Ez elméleti alapot nyújt a mikroorganizmusok Qianghuo vetőmagok nyugalmi állapotának enyhítésére történő felhasználásával kapcsolatos további kutatásokhoz, és fontos elméleti hivatkozásokkal szolgál a hasonló nyugalmi állapotú növények termesztéséhez.

A növények fontos szaporítószerveként a vetőmagok a hasznos mikroorganizmusoknak az anyanövényről a következő generációra történő átvitelének közegeként szolgálhatnak a vertikális szaporítás révén, ezáltal elősegítve a magok csírázását és a csemeték növekedését. A fűfélék, például a rizs és a kukorica magjaiban található endofita baktériumok fontos szerepet játszanak a magok csírázásában, a csemeték növekedésében és fejlődésében, valamint a gazdanövény növekedésében. A Dendrobium nobile Lindl. magjai utóérést mutatnak és nem tartalmaznak endospermiumszövetet, ezért a csírázáshoz mikroorganizmusokkal való szimbiózisra van szükség. A domináns endofita baktériumok elsősorban Proteobacteria és Cyanobacteria. Ez a tanulmány megállapította, hogy a Qianghuo magvak három különböző nyugalmi állapotban vannak, és az endofitikus baktériumközösségek típusai törzsszinten hasonlóak. Az endofitikus baktériumok főként Proteobacteria, Actinobacteria és Firmicutes baktériumokból állnak, ami összhangban van más növényi magvak domináns endofitikus baktériumtörzseivel. A Dendrobium officinale magjaihoz képest azonban a domináns endofita baktériumtörzsek eltéréseket mutatnak. A növényi váladékok típusai és a mikroorganizmusok kolonizációs, túlélési és magvakban való terjedési képességei eltérőek, ami a különböző növényi magvak endofita baktériumainak különbségeit eredményezi. Mivel a vetőmagokban lévő endofita baktériumok különböző növényi szervekből vagy merisztémás szövetekből származnak, a magembrióba és az endospermiumba mikrotubulus-kapcsolatokon vagy ivarsejteken keresztül kerülnek át és kolonizálódnak, és vertikálisan terjednek. A Qianghuo és a Dendrobium officinale gyógynövények magjai egyaránt nehezen csíráznak a dormancia jellemzőik miatt. A vizsgálatok azonban azt találták, hogy a két növény domináns endofita baktériumtörzse eltérő, ami az endofita baktériumok különböző forrásainak tudható be. A Qianghuo magvak a befejezetlen embriófejlődés miatt nyugalmi állapotban vannak, és endofitikus baktériumaik főként az endospermiumból származnak, míg a Dendrobium officinale magvak az endospermium hiánya miatt nyugalmi állapotban vannak. Endofita baktériumaik főként az embrióból származnak, így a kétféle törzstípus között különbségek vannak. Feltételezhető, hogy a Qianghuo magvaknak a csírázáshoz mikroorganizmusokkal is együtt kell élniük. A Qianghuo vetőmagjaiban GSC állapotban kis mennyiségű, a Bacteroidetes törzsbe tartozó endofita baktérium (2,01%) jelent meg, míg a GSB és GSC állapotban a vetőmagok 24,33% és 7,74% törzsébe tartozó ismeretlen endofita gombák jelentek meg. Ezek az endofita baktériumok fontos szerepet játszhatnak a vetőmagembrió növekedésének elősegítésében és a vetőmagok nyugalmi állapotának feloldásában, és a jövőbeni kutatások középpontjában fognak állni. Az endofita gombák nagy mennyiségben és sokféleséggel fordulnak elő számos növény magjában. A Qianghuo magvakban található endofita gombák főleg Ascomycota és Basidiomycota gombákból állnak, ami összhangban van a Phaseolus vulgaris L. magvakban és a Dendrobium nobile magvakban domináns endofita gombákkal.

A nemzetségek szintjén az endofita baktériumközösségek összetétele változik a GSA és a GSB státusz között, és az endofita baktériumközösségek típusai hasonlóak a GSB és a GSC státusz között. Az alfa-diverzitáselemzéssel megállapították, hogy az endofita baktériumok diverzitása a GSA-ban szignifikánsan alacsonyabb volt, mint a GSB-ben és a GSC-ben, míg a GSB és a GSC között nem volt szignifikáns különbség az endofita baktériumok diverzitásában. Ennek fő oka az lehet, hogy a GSA állapotban a Proteobacteria törzs abszolút előnyben volt, 97,08%-t tett ki, és ezáltal gátolta a többi baktérium növekedését. Ezzel szemben a GSB és GSC állapotokban a magvak hosszú ideig viszonylag hipoxikus környezetben voltak, ami viszonylag kevesebb versenyt eredményezett a mikroorganizmusok között, és nem volt jelentős gátló hatás a mikroorganizmusok között, ami magasabb diverzitási indexet eredményezett, mint a GSA állapotban. A vetőmagok teljes nyugalmi állapotból való felszabadulási folyamata során nem volt szignifikáns különbség az endofita gombaközösségek diverzitásában. A béta diverzitás PCoA analízise révén megállapítottuk, hogy az endofita baktériumok közösségi szerkezete jelentős változásokon ment keresztül a GSA állapotból a GSB, majd a GSC állapotba, míg az endofita gombák közösségi szerkezete nem változott jelentősen a GSA állapotból a GSB állapotba egészen a vetőmagok fiziológiai nyugalmi állapotának feloldásáig. A Qianghuo vetőmagok beérnek és földet érnek, és csak hosszú távú meleg és alacsony hőmérsékletű rétegző kezelés után rendelkeznek csírázóképességgel. Ez alatt az időszak alatt a vetőmagok endofita baktériumközösségének szerkezete megváltozik, ami arra utal, hogy ez az egyik fő befolyásoló tényezője annak, hogy a Qianghuo vetőmagok csírázóképességgel rendelkezzenek, és a hatásmechanizmus további kutatásokat igényel.
Az endofita baktériumok szerepe a növényi magvakban nem tisztázott, de számos tanulmány kimutatta, hogy az endofita baktériumok szabályozó hatással vannak a gazdanövényekre és a magvakra. A répafű endofita baktériumai képesek citokinint termelni, és kölcsönhatásba léphetnek a növény által termelt növényi hormonokkal, ezáltal szabályozva a magok nyugalmi állapotát. A vetőmagban lévő endofita baktériumok a növényi hormonok termelésével vagy a növényi tápanyagok, különösen a nitrogén és a foszfor felszívódásának elősegítésével a növény növekedését is elősegíthetik. Ez a tanulmány a GSA, GSB és GSC jellegzetes mikroorganizmusait elemezte tovább nemzetségszinten. Összesen 15 endofitikus baktériumot találtak, az endofitikus gombáknál pedig nem voltak jellemző mikroorganizmusok. Ezek a mikroorganizmusok a többi nyugalmi stádiumhoz képest viszonylag nagy számban fordultak elő a megfelelő nyugalmi stádiumokban, és fontos szerepet játszhatnak a Qiangfu vetőmagok morfológiai és fiziológiai nyugalmi állapotának felszabadításában, így a jövőbeli kutatások szempontjából kulcsfontosságú mikrobapopulációvá válhatnak. Közülük a domináns baktériumnemzetségek a GSA-státuszban az Erwinia és a Pseudomonas. A Pseudomonas számos gyümölcs és zöldség romlási folyamatában vesz részt, a romlást okozó baktériumok közül körülbelül 50%-90% Pseudomonas. Az Erwinia által szekretált pektinsav-liáz és pektin-metilgalakturonát enzim szinergista hatást fejt ki a növényi szövetek lágyítására, amely lebontja a növényi sejtfal pektinjét, és lágyulást és romlást okozhat. E vizsgálat eredményei azt mutatják, hogy a frissen betakarított Qiangfu magokat azonnal homokban kell tárolni a romlás megelőzése és a magok csírázásának befolyásolása érdekében. Huang Zhiyuan és munkatársai megállapították, hogy az Erwinia nemzetség relatív abundanciája a Phyllostachys nuda bambuszhajtásokban a tárolási hőmérséklet növekedésével csökkent a tárolás során. Ez a tanulmány azt találta, hogy a frissen betakarított Qiangfu magok bősége jelentősen csökkent a meleg hőmérsékletű (15 ℃) kezelés után, ami összhangban van a korábbi kutatási eredményekkel. Ez összefügghet azzal, hogy a magok endospermiumát meleg hőmérsékleten és homokos tárolási kezelésnek vetették alá, és a domináns baktérium nemzetségek, amelyek megjelentek, lebontották az endospermiumot, nagy mennyiségű energiát termeltek az embriók fejlődéséhez, közvetve gátolva azok növekedését. Amikor a Qianghuo magok beérnek és földet érnek, az embrió még nem fejlődött ki, és akár 8 hónapig is meleg homokban kell tárolni, hogy morfológiai nyugalmi állapotát feloldják, ami a csírázást nehezen lebontható csírázást gátló anyagok jelenlétével függ össze az endospermiumban. A vörös úszó baktérium nemzetség denitrifikációs képességgel rendelkezik, és olyan funkcionális baktérium, amely képes lebontani a szerves anyagokat és egyes nehezen lebontható nitrogéntartalmú vegyületeket. Ez a tanulmány megállapította, hogy a GSB állapotban a domináns endofita baktériumok a vörös úszó baktérium nemzetség és a Catellatospora nemzetség, amelyek szerepet játszhatnak a csírázásgátlók lebontásában és az embrió növekedésének elősegítésében, és a jövőbeli kutatások kulcsfontosságú mikrobiális csoportjai. A domináns baktérium nemzetségek a GSC státuszban a Deinococcus, Steridobacterium, Rhizobium, Mucococcus, Mycobacterium, Hydrobacteria, Micromonospora, Actinobacteria, Bacillus, Flavobacterium és Myceticola nemzetségek. A kutatások szerint a Dvoras nemzetség nitrogénkötő baktérium; a lassan növekvő rhizobiumok képesek a szervetlen foszfátok feloldására, ami növelheti a növényi fotoszintézis pigmenttartalmát; a Mycetocola törzset eredetileg a Mi Dui gleccseren fedezték fel, és hidegnek ellenálló mikroorganizmus. A meleg homokos tárolás által a nyugalmi állapotból való felszabadítás után a Qianghuo magok nem képesek csírázni. Alacsony hőmérsékletű homoktárolással kell kezelni őket, mielőtt csírázni tudnának. Feltételezhető, hogy a nyugalmi állapotból való felszabadulás után az endospermium kimerül, és nem képes kielégíteni az embrió és az embriógyökér további növekedéséhez szükséges energiát. A nitrogéntartalmú csírázásgátlóknak a vörös mozgékony mikroorganizmusok által a nyugalmi állapot feloldása során felhalmozott nitrogéntermékek lebontása során keletkező nitrogéntermékeket az embrió nem tudja közvetlenül felvenni. Ezeket a nitrogénkötő mikroorganizmusok által a növény által felvehető nitrogénné kell átalakítani, hogy elősegítsék az embrió növekedését és az embriógyökér áttörését a maghéjon keresztül. Feltételezések szerint a nitrogénkötő mikroorganizmusoknak a Myceticola mikroorganizmusokkal kell együttműködniük a normális növekedéshez, míg a Myceticola mikroorganizmusok csak alacsony hőmérsékletű környezetben képesek normálisan növekedni. Ezért a Qianghuo vetőmagoknak a nyugalmi állapot feloldása után egy bizonyos időszakon kell átesniük. Csak az alacsony hőmérsékletű kezelés után képes az embrionális gyökér áttörni a maghéjat, A magok képesek csírázni. Feltételezhető, hogy a lassan növekvő rhizobiumok jellegzetes mikroorganizmusai a GSC állapotú embriókban növelhetik a fotoszintetikus pigmentek tartalmát az embriókban, előkészítve az embriók fotoszintézisét.
Mivel a Qianghuo vetőmagok prototípusos embrióként vagy embrió nélkül érnek és landolnak, a vetőmagembriók növekedése a mesterséges termesztés során nagyon lassú, ami hosszú csírázási időt és nehéz csírázási folyamatot eredményez a Qianghuo vetőmagoknál. Természetes állapotban a csírázás akár 11 hónapig is eltarthat. Sürgősen meg kell találni azokat a mikroorganizmusokat a mikroorganizmusok szempontjából, amelyek elősegítik a vetőmagembriók növekedését, hogy felszabadítsák morfológiai és fiziológiai nyugalmi állapotukat, erős támogatást nyújtva a Qianghuo mesterséges termesztésének fejlesztéséhez. Ez a kísérlet a Qiangfu vetőmagok különböző nyugalmi állapotaiban az endofita baktériumok és gombák közösségi szerkezetének összetételét és különbségeit mélyrehatóan tanulmányozta a tenyésztésmentes nagy áteresztőképességű szekvenálási módszerekkel. Az egyes nyugalmi állapotok jellegzetes mikroorganizmusait elemeztük. Ez a tanulmány új ötletet nyújt a Qiangfu vetőmagok nyugalmi állapotának feloldására szolgáló mikrobiális módszerek alkalmazásához, kitölti a vetőmagok nyugalmi állapotának feloldását elősegítő mikrobiális módszerek kutatási területén fennálló hiányosságokat, és megalapozza e potenciális endofita baktériumforrások további felhasználását a nyugalmi állapot feloldását elősegítő hatásokkal a Qiangfu vetőmagok csírázási arányának javítása és a mesterséges termesztésben történő szabványosított fejlődésük elősegítése érdekében. Várhatóan elméleti útmutatást nyújt a mikrobiális módszerek, például a vetőmagok nyugalmi állapotának gyors feloldására szolgáló mérnöki törzsek vagy mikrobiális készítmények alkalmazásához.