Basándose en el acoplamiento molecular y la cinética de inhibición enzimática, explorar la actividad inhibidora de la α - glucosidasa in vitro extraída de Rhodiola rosea. La diabetes es una enfermedad común, que puede dividirse en dos tipos: diabetes tipo 1 (T1DM) y diabetes tipo 2 (T2DM). La DMT2 representa más del 90% de los pacientes diabéticos, y está causada principalmente por un aumento de la glucemia postprandial debido a la resistencia a la insulina y a una secreción anormal de insulina. La alfa glucosidasa es una de las principales enzimas causantes de la hiperglucemia postprandial, y la inhibición de la actividad de la alfa glucosidasa se ha convertido en la principal forma de controlar la hiperglucemia postprandial y tratar la DMT2. En la actualidad, los inhibidores de la alfa glucosidasa utilizados habitualmente en la práctica clínica son la acarbosa, el miglitol, etc. Aunque tienen una elevada actividad inhibidora, son caros y propensos a una serie de reacciones gastrointestinales como la indigestión. Los productos naturales derivados de plantas se han convertido en fuentes de agentes terapéuticos de alta calidad debido a su baja toxicidad y efectos secundarios. Por ello, la búsqueda de inhibidores de la alfa glucosidasa seguros y con escasas reacciones adversas a partir de sustancias activas naturales se ha convertido en un punto candente de la investigación.

Rhodiola sachalinensis, como uno de los materiales medicinales chinos tradicionales con homología de alimentos y medicinas, contiene salidrosida, catequina, tirosol y otros ingredientes activos. En la actualidad, la investigación nacional e internacional se centra principalmente en la lucha contra la hipoxia, la apoptosis, los tumores, el alivio de los daños causados por el estrés, etc. Algunos estudios también muestran que tiene un cierto papel en modelos de roedores de la diabetes, y puede aliviar la hiperglucemia, hiperlipidemia, y los síntomas de azúcar en la orina en ratones con diabetes mediante la activación de 5 '- adenosina monofosfato dependiente de la proteína quinasa (AMPK) relacionados con las vías de señalización. Recientemente, los investigadores han encontrado que el extracto de Rhodiola puede reducir significativamente los niveles de glucosa en sangre postprandial en ratones, y sus ingredientes activos muestran un cierto grado de efecto inhibidor in vitro, pero el mecanismo específico de inhibición no está claro. La investigación preliminar de nuestro equipo descubrió que las sustancias polifenólicas de la Rhodiola rosea tienen cierta actividad inhibidora in vitro de la alfa glucosidasa. Basado en los antecedentes de la investigación anterior, este estudio combina la cinética de inhibición enzimática, UHPLC-QE-MS, y la tecnología de acoplamiento molecular para explorar el efecto inhibitorio del extracto de Rhodiola rosea sobre la alfa glucosidasa de una manera visualizada. La investigación tiene como objetivo proporcionar una referencia teórica para el desarrollo de fármacos hipoglucemiantes y alimentos saludables, con el fin de promover un mayor desarrollo y utilización de la Rhodiola rosea.

 

 

La alfa glucosidasa se encuentra en el borde en cepillo de la mucosa del intestino delgado y puede descomponer oligosacáridos o disacáridos en monosacáridos. La inhibición de su actividad puede ralentizar la hidrólisis de carbohidratos y la tasa de producción de glucosa, reduciendo así la absorción de glucosa por el intestino delgado y la glucemia postprandial. Las investigaciones demuestran que los extractos de varias plantas, como la manzana estrellada, el plátano pata de elefante, la baya de lobo negra, la Schisandra chinensis, el ñame púrpura y el diente de león de Guizhou, tienen actividad inhibidora contra la alfa glucosidasa. La concentración inhibitoria media máxima (IC50) puede utilizarse para evaluar el efecto inhibidor de los inhibidores sobre las enzimas. Cuanto menor es la IC50, mayor es la actividad inhibidora. Las investigaciones previas del equipo han demostrado que los polifenoles de Rhodiola tienen un buen efecto inhibidor sobre la alfa glucosidasa, con una IC50 de 2,83mg/mL. La IC50 de la RCE obtenida en este experimento es de 1,538mg/mL, que no sólo es inferior a la de la acarbosa, sino también a la de los polifenoles de Rhodiola. Esto puede deberse a la presencia de flavonoides, ácidos orgánicos y otras sustancias en el RCE. Los tipos de inhibición enzimática por inhibidores pueden dividirse en inhibición reversible e inhibición irreversible. El RCE y la α - glucosidasa obtenidos en este estudio son de inhibición reversible, caracterizada por la unión no covalente entre el inhibidor y la enzima, que puede restaurar la actividad enzimática mediante métodos físicos. Los tipos de inhibición reversible pueden dividirse a su vez en cuatro categorías: inhibición competitiva, inhibición no competitiva, inhibición anticompetitiva e inhibición mixta. Los tipos de inhibición mixta incluyen la inhibición competitiva y la inhibición mixta no competitiva. La característica de este tipo es que un aumento de la concentración del inhibidor reducirá la velocidad de reacción máxima (Vmax) de la reacción enzimática y aumentará la constante de Michaelis (Km). Este estudio muestra que un aumento en la concentración de RCE conduce a una disminución en Vmax El aumento en Km es consistente con las características anteriores, por lo tanto el tipo de inhibición de RCE en α - glucosidasa se determina que es un tipo mixto de inhibición competitiva y no competitiva, lo que indica que el extracto de Rhodiola es un eficaz inhibidor natural de α - glucosidasa. RCE es consistente con los tipos de inhibición de α - glucosidasa por polifenoles de Rhodiola rosea, polisacáridos de Schisandra chinensis, y polisacáridos de Scenedesmus macrophylla. Sin embargo, es necesario aclarar qué compuestos pertenecen a la inhibición competitiva y qué compuestos pertenecen a la inhibición no competitiva, y se necesita una mayor exploración. El RCE tiene una buena actividad inhibidora de la α - glucosidasa, pero se necesitan más modelos animales para verificar si el efecto es significativo in vivo. En la actualidad, existen muchas fuentes de alfa glucosidasa, entre las que se incluyen principalmente la levadura de cerveza, el Aspergillus niger, el Bacillus subtilis termófilo y el Leuconostoc enterica. Las propiedades de la α - glucosidasa de diferentes fuentes varían enormemente, y la α - glucosidasa utilizada en este estudio procede de la levadura de cerveza. Por lo tanto, es necesario seguir investigando para determinar si el RCE tiene el mismo efecto inhibidor sobre las enzimas de otras fuentes.
La UHPLC-QE-MS tiene las características de velocidad y precisión, y puede utilizarse para el análisis no objetivo de compuestos en materiales medicinales chinos complejos. Este estudio analizó RCE e identificó 1245 compuestos a través de la comparación con la base de datos, incluyendo 263 compuestos en modo de iones negativos y 982 compuestos en modo de iones positivos. Los principales disolventes para extraer los principios activos de la Rhodiola rosea son el etanol y el agua. En comparación con el agua pura, las soluciones acuosas de disolventes orgánicos pueden extraer más compuestos. El contenido de ácido gálico en el extracto acuoso es mayor que en el extracto alcohólico, mientras que el contenido de tirosol, ácido clorogénico y taninos es menor que en el extracto alcohólico acuoso. Por lo tanto, para extraer más compuestos, en este experimento se utilizó etanol 50% como disolvente para la preparación de la extracción RCE. Sin embargo, debido al disolvente de extracción único, los compuestos detectados pueden no ser necesariamente todos los compuestos de Rhodiola rosea, y todavía hay algunos compuestos que no pueden ser extraídos o identificados. Por lo tanto, se necesitan más experimentos comparativos con diferentes disolventes de extracción. La investigación de Zakharenko muestra que los principales ingredientes activos de la Rhodiola rosea son el salidrosido, la luteolina, la catequina, la quercetina, el extracto de hierbas y la catequina. Esto concuerda con los resultados de este estudio, ya que la RCE contiene altos niveles de luteolina y quercetina. El acoplamiento molecular puede predecir si los ligandos de moléculas pequeñas pueden unirse a las proteínas receptoras y las fuerzas de unión implicadas. En este estudio, 20 compuestos con alto contenido obtenidos de UHPLC-QE-MS fueron acoplados con α - glucosidasa. Los resultados mostraron que 11 compuestos podrían unirse a la α - glucosidasa, incluyendo luteolina, salidrosida, kaempferol, (-) - epicatequina 3-O-galato, ácido cafeico, ácido L-málico, (+) - epicatequina, quercetina, (-) - eritrotiro-anetol glicol 1-glucósido, 3-hidroxi-4,6-heptyne-1-il 1-glucósido, y tirosol. Entre ellos, el ácido cafeico fue el que formó más enlaces de hidrógeno. Puede unirse a los residuos His-515, Arg-437, Glu-432 e His-348. (+) - La epicatequina tiene la mejor actividad de unión con Asn-443 e His-515, con la energía de unión más baja (-17,08 kJ/mol); el docking PNPG con α - glucosidasa reveló que Arg-437 y Glu-432 son sus dos sitios de unión. El ácido cafeico comparte los mismos sitios de unión con el PNPG, Arg-437 y Glu-432, mientras que el ácido L-málico, la quercetina, y el tirosol comparten el mismo sitio de unión con el PNPG, Arg-437. Por lo tanto, se infiere que los tipos de inhibición del ácido cafeico, el ácido L-málico, la quercetina y el tirosol sobre la α - glucosidasa pueden ser de inhibición competitiva, mientras que los otros seis compuestos son de inhibición no competitiva. Sin embargo, es necesario purificar más los compuestos y realizar gráficos recíprocos de Lineweaver Burk para determinar sus tipos de inhibición.
En resumen, este estudio exploró el efecto inhibidor de RCE en α - glucosidasa de una manera visualizada a través de la cinética de inhibición enzimática, UHPLCQE-MS, y técnicas de acoplamiento molecular. El tipo de inhibición fue un tipo mixto de inhibición competitiva y no competitiva, y la actividad de unión entre (+) - epicatequina y α - glucosidasa fue la mejor en RCE. Este artículo proporciona una investigación básica para el desarrollo del RCE como inhibidor natural de la alfa glucosidasa y la utilización de los recursos de Rhodiola.