Análisis de la composición y diferencias de las comunidades bacterianas endofíticas en diferentes estados de latencia de las semillas de Qianghuo
Notopterygium incisum Ting ex H. T. Chang es una especie vegetal de la familia de las umbelíferas. Sus rizomas secos se utilizan como medicamento y se emplean habitualmente en la medicina tradicional china y tibetana, conocida como medicina negra. Tiene una gran demanda en el mercado. En la actualidad, el Qianghuo procede principalmente de recursos silvestres y se distribuye sobre todo en zonas de pastizales arbustivos a una altitud de 3000-4500 m en Sichuan, Gansu, Qinghai y otros lugares. En los últimos años, la excavación excesiva ha causado grandes daños al entorno ecológico, y los recursos vivos silvestres de Qiang se acercan a su agotamiento. Por lo tanto, se necesita urgentemente la domesticación artificial y el cultivo.
Cuando las semillas de Qianghuo maduran y aterrizan, el desarrollo embrionario es incompleto, y a menudo no hay embrión o se produce un fenómeno de embrión primitivo. Tiene una doble característica de latencia morfológica y fisiológica, y pertenece a las semillas de latencia profunda. La tasa de germinación de las semillas de Qianghuo en entornos naturales es extremadamente baja (0,52%). El método efectivo actual para aliviar la latencia de las semillas de Qianghuo es el método GA+almacenamiento en arena a temperatura variable. En primer lugar, el método de almacenamiento en arena a temperatura cálida se utiliza para aliviar su latencia morfológica y, a continuación, el tratamiento de almacenamiento en arena a baja temperatura es necesario para aliviar su latencia fisiológica antes de que las semillas puedan tener capacidad de germinación. El tiempo de tratamiento de las semillas puede durar más de 8 meses. Utilizando este método para tratar las semillas de Qianghuo, la tasa de germinación más alta es de 21,2%. Además, el ciclo de crecimiento de las hierbas medicinales Qianghuo es de más de 4 años, y debido al largo ciclo de inversión y la lenta efectividad, el desarrollo del cultivo artificial es muy lento. En la actualidad, sólo se dispone de cultivos esporádicos, que no pueden satisfacer las necesidades de desarrollo sostenible del mercado de Qianghuo. La tecnología de liberación manual de la latencia de las semillas de Qianghuo no ha avanzado mucho en la última década, lo que constituye uno de los principales problemas que restringen el cultivo a gran escala de Qianghuo.
Las bacterias endofíticas de las plantas son hongos o bacterias que viven en diversos tejidos y órganos de plantas sanas en algunas o en todas las fases de su ciclo vital. Forman una relación mutualista compleja y especial con la planta huésped en coexistencia a largo plazo, y promueven la división celular, el desarrollo de las raíces y el crecimiento de las plántulas aumentando el metabolismo de la auxina y los mitógenos en la planta. La latencia de las semillas está controlada por el equilibrio entre los promotores del crecimiento giberelina y los inhibidores del crecimiento ácido abscísico. Las investigaciones han descubierto que las bacterias endofíticas pueden regular la latencia de las semillas regulando o induciendo la síntesis de hormonas endógenas en las plantas, lo que proporciona una base teórica para explorar los recursos de bacterias endofíticas con funciones promotoras del crecimiento en las semillas. Pu Fengya et al. descubrieron que las bacterias endofíticas de las lágrimas de Job pueden aumentar la tasa de germinación de las semillas de lágrimas de Job, arroz y trigo, y promover el crecimiento de las plántulas induciendo el crecimiento de las raíces. Lei Ruifeng descubrió que las bacterias endofíticas de las semillas de langosta de arena plateada promueven la germinación de las semillas regulando su metabolismo. Xiang Yiqing y otros descubrieron que las bacterias endofíticas en las semillas de Huanglian pueden mejorar significativamente la tasa de germinación de las semillas de Huanglian. Las bacterias endófitas de la pimienta de Sichuan (Capsicum annuum), el arroz (Oryza sativa L.) y el Dendrobium catenatum promueven directamente el crecimiento y el desarrollo de las plantas huésped mediante la secreción de hormonas endógenas como la auxina, el ácido abscísico, la citoquinina, el ácido giberélico, etc. Las bacterias endofíticas aisladas de las semillas de Achnatherum inebrians, Dendrobium nobile y Lolium rigidum, así como las bacterias endofíticas aisladas de las raíces de Polygonatum multiflorum L., regulan la latencia de las semillas mediante la secreción de hormonas endógenas como la citoquinina, mejorando significativamente sus tasas de germinación y supervivencia. Sin embargo, ¿pueden las bacterias endofíticas de las semillas de Qianghuo promover la liberación de la latencia favoreciendo el crecimiento de su embrión? Basándose en esto, este experimento toma las semillas Qianghuo como objeto de investigación y utiliza la tecnología de secuenciación de alto rendimiento Illumina MiSeq culture free para estudiar la composición y las diferencias de las comunidades bacterianas endófitas en diferentes estados de latencia de las semillas Qianghuo. Esto proporciona una base teórica para futuras investigaciones sobre el uso de microorganismos para aliviar la latencia de las semillas Qianghuo y también proporciona importantes referencias teóricas para el cultivo de plantas con características similares de latencia.

Como importante órgano reproductor de las plantas, las semillas pueden servir de medio para la transmisión de microorganismos beneficiosos de las plantas madre a la siguiente generación a través de la propagación vertical, promoviendo así la germinación de las semillas y el crecimiento de las plántulas. Las bacterias endofíticas de las semillas de gramíneas como el arroz y el maíz desempeñan un papel importante en la germinación de las semillas, el crecimiento y desarrollo de las plántulas y el crecimiento de la planta huésped. Las semillas de Dendrobium nobile Lindl. presentan posmaduración y carecen de tejido endospermático, por lo que requieren la simbiosis con microorganismos para su germinación. Las bacterias endofíticas dominantes son principalmente proteobacterias y cianobacterias. Este estudio descubrió que las semillas de Qianghuo se encuentran en tres estados de latencia diferentes, y los tipos de comunidades bacterianas endófitas son similares a nivel de filo. Las bacterias endofíticas se componen principalmente de Proteobacteria, Actinobacteria y Firmicutes, lo que coincide con los filos bacterianos endofíticos dominantes de otras semillas de plantas. Sin embargo, en comparación con las semillas de Dendrobium officinale, su filo bacteriano endofítico dominante presenta diferencias. Los tipos de secreciones de las plantas y la capacidad de los microorganismos para colonizar, sobrevivir y propagarse a las semillas varían, lo que da lugar a diferencias en las bacterias endofíticas de las distintas semillas de plantas. Dado que las bacterias endofíticas de las semillas proceden de diferentes órganos vegetales o tejidos meristemáticos, se transfieren y colonizan el embrión de la semilla y el endospermo a través de conexiones microtubulares o gametos, y se propagan verticalmente. Las semillas de las plantas medicinales Qianghuo y Dendrobium officinale tienen dificultades para germinar debido a sus características de latencia. Sin embargo, los estudios han descubierto que los filos de bacterias endofíticas dominantes de ambas presentan diferencias, lo que puede deberse a sus diferentes fuentes de bacterias endofíticas. Las semillas de Qianghuo son latentes debido al desarrollo incompleto del embrión, y sus bacterias endofíticas proceden principalmente del endospermo, mientras que las semillas de Dendrobium officinale son latentes debido a la falta de endospermo. Sus bacterias endofíticas proceden principalmente del embrión, por lo que existen diferencias en los tipos de filo entre ambas. Se especula que las semillas de Qianghuo también necesitan coexistir con microorganismos para germinar. Una pequeña cantidad de bacterias endofíticas pertenecientes al filo Bacteroidetes (2,01%) apareció en las semillas de Qianghuo en el estado GSC, mientras que hongos endofíticos desconocidos pertenecientes al filo Bacteroidetes aparecieron en 24,33% y 7,74% de las semillas en los estados GSB y GSC, respectivamente. Estas bacterias endofíticas pueden desempeñar un papel importante en la promoción del crecimiento del embrión de la semilla y la liberación de la latencia de la semilla, y serán objeto de futuras investigaciones. Los hongos endofíticos son muy abundantes y diversos en las semillas de muchas plantas. Los hongos endofíticos de las semillas de Qianghuo están compuestos principalmente por Ascomycota y Basidiomycota, lo que concuerda con los hongos endofíticos dominantes en las semillas de Phaseolus vulgaris L. y Dendrobium nobile.

A nivel de género, la composición de las comunidades de bacterias endófitas cambia del estado GSA al GSB, y los tipos de comunidades de bacterias endófitas son similares del GSB al GSC. Mediante el análisis de diversidad Alpha, se descubrió que la diversidad de bacterias endófitas en GSA era significativamente menor que en GSB y GSC, mientras que no había diferencias significativas en la diversidad de bacterias endófitas entre GSB y GSC. La razón principal puede ser que en el estado GSA, el filo Proteobacteria tenía una ventaja absoluta, representando 97,08%, inhibiendo así el crecimiento de otras bacterias. Por el contrario, las semillas en los estados GSB y GSC estuvieron en un ambiente relativamente hipóxico durante mucho tiempo, lo que provocó una competencia relativamente menor entre microorganismos y ningún efecto inhibitorio significativo entre microorganismos, dando lugar a un índice de diversidad mayor que en el estado GSA. No hubo diferencias significativas en la diversidad de las comunidades de hongos endófitos durante todo el proceso de liberación de la latencia de las semillas. A través del análisis PCoA de diversidad Beta, se encontró que la estructura de la comunidad de bacterias endofíticas sufrió cambios significativos de GSA a GSB y luego al estado GSC, mientras que la estructura de la comunidad de hongos endofíticos no cambió significativamente de GSA a GSB hasta que se liberó la latencia fisiológica de las semillas. Las semillas de Qianghuo maduran y aterrizan, y sólo tienen capacidad germinativa tras un tratamiento de estratificación a largo plazo con calor y baja temperatura. Durante este periodo, la estructura de la comunidad bacteriana endofítica de las semillas cambia, lo que indica que éste es uno de los principales factores que influyen en la capacidad germinativa de las semillas de Qianghuo, y que su mecanismo de acción requiere más investigación.
La función de las bacterias endofíticas en las semillas de plantas no se ha dilucidado, pero un gran número de estudios han demostrado que las bacterias endofíticas tienen efectos reguladores en las plantas huésped y las semillas. Las bacterias endofíticas del ray-grass pueden producir citoquininas e interactuar con las hormonas vegetales producidas por la planta, regulando así la latencia de las semillas. Las bacterias endofíticas de las semillas también pueden promover el crecimiento de la planta produciendo hormonas vegetales o facilitando la absorción de nutrientes vegetales, especialmente nitrógeno y fósforo. En este estudio se analizaron los microorganismos característicos de GSA, GSB y GSC a nivel de género. Había un total de 15 bacterias endofíticas y ningún microorganismo característico en los hongos endofíticos. Estos microorganismos eran relativamente abundantes en sus respectivos estados de latencia en comparación con otros estados de latencia, y pueden desempeñar un papel importante en la liberación de la latencia morfológica y fisiológica de las semillas de Qiangfu, lo que los convierte en una población microbiana clave para futuras investigaciones. Entre ellos, los géneros bacterianos dominantes en el estado GSA son Erwinia y Pseudomonas. Pseudomonas está implicada en el proceso de deterioro de muchas frutas y verduras, y entre 50% y 90% de las bacterias de deterioro son Pseudomonas. La liasa ácida de pectina y la enzima metilgalacturonato de pectina secretadas por Erwinia tienen un efecto sinérgico en el ablandamiento de los tejidos vegetales, que puede degradar la pectina de la pared celular de la planta y causar ablandamiento y deterioro. Los resultados de este estudio indican que las semillas de Qiangfu recién cosechadas deben almacenarse rápidamente en arena para evitar que se estropeen y afecten a la germinación de las semillas. Huang Zhiyuan et al. descubrieron que la abundancia relativa del género Erwinia en los brotes de bambú Phyllostachys nuda disminuía con el aumento de la temperatura durante el almacenamiento. Este estudio encontró que la abundancia de semillas de Qiangfu recién cosechadas disminuyó significativamente después del tratamiento con temperatura cálida (15 ℃), lo que coincide con los resultados de investigaciones anteriores. Esto puede estar relacionado con el hecho de que el endospermo de las semillas fue sometido a un tratamiento de temperatura cálida y almacenamiento en arena, y los géneros bacterianos dominantes que aparecieron descompusieron el endospermo produciendo una gran cantidad de energía para el desarrollo embrionario, inhibiendo indirectamente su crecimiento. Cuando las semillas de Qianghuo maduran y aterrizan, el embrión aún no se ha desarrollado y necesita almacenarse en arena caliente hasta 8 meses para liberar su latencia morfológica, lo que está relacionado con la presencia en el endospermo de inhibidores de la germinación difíciles de biodegradar. El género de bacterias nadadoras rojas tiene capacidad de desnitrificación y es una bacteria funcional que puede degradar la materia orgánica y algunos compuestos que contienen nitrógeno difíciles de biodegradar. Este estudio descubrió que en el estado GSB, las bacterias endofíticas dominantes son el género de bacterias móviles rojas y el género Catellatospora, que pueden desempeñar un papel en la degradación de los inhibidores de la germinación y en la promoción del crecimiento embrionario, y son los grupos microbianos clave para futuras investigaciones. Los géneros bacterianos dominantes en el estado GSC son los géneros Deinococcus, Steridobacterium, Rhizobium, Mucococcus, Mycobacterium, Hydrobacteria, Micromonospora, Actinobacteria, Bacillus, Flavobacterium y Myceticola. Las investigaciones han descubierto que el género Dvoras es una bacteria fijadora de nitrógeno; Los rizobios de crecimiento lento tienen la capacidad de disolver fosfatos inorgánicos, lo que puede aumentar el contenido de pigmentos de la fotosíntesis de las plantas; La cepa Mycetocola se descubrió inicialmente en el glaciar Mi Dui y es un microorganismo resistente al frío. Las semillas de Qianghuo, una vez liberadas del letargo por el almacenamiento en arena caliente, no tienen la capacidad de germinar. Deben ser tratadas con arena almacenada a baja temperatura antes de que puedan germinar. Se especula que tras la liberación de la latencia, el endospermo se agotará y será incapaz de satisfacer la energía necesaria para el crecimiento ulterior del embrión y la raíz embrionaria. Los productos nitrogenados producidos por la degradación de los inhibidores de la germinación que contienen nitrógeno por microorganismos móviles rojos acumulados durante la fase de liberación de la latencia no pueden ser absorbidos directamente por el embrión. Deben ser convertidos en nitrógeno que pueda ser absorbido por la planta por microorganismos fijadores de nitrógeno para promover el crecimiento del embrión y el avance de la raíz embrionaria a través de la cubierta de la semilla. Se especula que los microorganismos fijadores de nitrógeno necesitan cooperar con los microorganismos Myceticola para crecer normalmente, mientras que los microorganismos Myceticola sólo pueden crecer normalmente en ambientes de baja temperatura. Por lo tanto, las semillas de Qianghuo deben someterse a un periodo de tiempo tras la liberación de la latencia. Sólo después del tratamiento a baja temperatura puede la raíz embrionaria atravesar la cubierta de la semilla, y las semillas tienen la capacidad de germinar. Se especula que los microorganismos característicos de los rizobios de crecimiento lento en los embriones en estado GSC pueden aumentar el contenido de pigmentos fotosintéticos en los embriones, preparando la fotosíntesis en los embriones.
Debido al hecho de que las semillas Qianghuo maduran y aterrizan como embriones prototipo o sin embriones, el crecimiento de los embriones de las semillas durante el cultivo artificial es muy lento, lo que resulta en un largo tiempo de germinación y un difícil proceso de germinación de las semillas Qianghuo. En estado natural, tardan hasta 11 meses en germinar. Es urgente encontrar microorganismos desde la perspectiva de los microorganismos que promueven el crecimiento de embriones de semillas para liberar su latencia morfológica y fisiológica, proporcionando un fuerte apoyo para el desarrollo del cultivo artificial de Qianghuo. Este experimento llevó a cabo un estudio en profundidad sobre la composición de la estructura de la comunidad y las diferencias de las bacterias y los hongos endofíticos en diferentes estados de latencia de las semillas de Qiangfu mediante métodos de secuenciación de alto rendimiento sin cultivo. Se analizaron los microorganismos característicos de cada estado de latencia. Este trabajo proporciona una nueva idea para el uso de métodos microbianos para aliviar la latencia de las semillas de Qiangfu, llena el vacío en el campo de la investigación de la promoción microbiana de la liberación de la latencia de las semillas, y sienta las bases para una mayor utilización de estos recursos potenciales de bacterias endofíticas con efectos promotores de la liberación de la latencia para mejorar la tasa de germinación de las semillas de Qiangfu y promover su desarrollo estandarizado en el cultivo artificial. Se espera que proporcione una guía teórica para el uso de métodos microbianos tales como la ingeniería de cepas o preparaciones microbianas para aliviar rápidamente la latencia de las semillas.