Studie über die Aktivität und den Mechanismus von RCE-4, einem Wirkstoff aus Glücksgras, bei der Hemmung der Proliferation, Invasion und Migration von Ca-Ski-Zellen bei Gebärmutterhalskrebs
Gebärmutterhalskrebs ist ein häufiger gynäkologischer bösartiger Tumor, der derzeit in der klinischen Praxis hauptsächlich durch Operation, Strahlen- und Chemotherapie behandelt wird. Da es sich bei Gebärmutterhalskrebs jedoch meist um einen invasiven Tumor handelt, der leicht metastasiert und sich ausbreitet, sind die Behandlungserwartungen oft gering. Daher hat die Suche nach neuen Chemotherapeutika gegen Gebärmutterhalskrebs, die seine Invasion und Migration hemmen können, viel Aufmerksamkeit auf sich gezogen. Wirkstoffe aus natürlichen Quellen werden von Wissenschaftlern aufgrund ihrer Multitargeting-Eigenschaften, ihrer Wirksamkeit und ihrer geringen Toxizität hoch geschätzt. RCE-4 ist ein Spirostansaponin, das in unserem Labor aus Reineckia carnea (Andr.) Kunth, einer Pflanze aus der Familie der Liliaceae, isoliert wurde. Seine chemische Bezeichnung ist (1 β, 3 β, 5 β, 25S) - Spirostan-1,3-diol1- [α - L-Rhamnose - (1 → 2) - β - D-Xylopyranosid. Die Struktur ist in Abbildung 1 dargestellt, und es hat den höchsten Gehalt (bis zu 13%) in den gesamten Saponinen von Reineckia carnea (Andr.) Kunth. Gleichzeitig ist seine pharmakologische Aktivität auch die beste. RCE-4 wurde als ein wichtiger Bestandteil von Reineckia carnea in die Standards der lokalen chinesischen Kräutermedizin der Provinz Hubei aufgenommen.
Frühere Forschungen in unserem Labor haben ergeben, dass RCE-4 eine gute selektive Zytotoxizität gegen Gebärmutterhalskrebs-Ca-Ski-Zellen besitzt und das Wachstum von Ca-Ski-Zelltransplantationstumoren in der Nacktmaus erheblich hemmen kann. Die höchste Tumorhemmungsrate kann 69,1% erreichen. In wichtigen Geweben wie der Gebärmutter und den Eierstöcken der behandelten Mäuse wurden keine Tumorzellmetastasen, Infiltrationen oder pathologische Veränderungen beobachtet. In Anlehnung an frühere Ergebnisse vermuten wir, dass RCE-4 die Invasion und Migration von Gebärmutterhalskrebszellen hemmen kann. Derzeit gibt es keine Berichte über die damit verbundenen Aktivitäten und molekularen Wirkmechanismen.
Wnt/β-Catenin und Hippo/YAP sind zwei intrazelluläre Signalwege, die eng mit der Invasion und Migration von Tumoren verbunden sind. Beide Wege regulieren die Tumorinvasion und -migration, indem sie über ihre zentralen Signalmoleküle (β-Catenin und YAP/TAZ) in den Zellkern gelangen und sich mit Transkriptionsfaktoren verbinden, um nachgeschaltete Zielgene zu transkribieren. Die Blockierung des Wnt/β-Catenin-Signalwegs hat eine signifikante hemmende Wirkung auf die Tumorproliferation. Eine abnormale Aktivierung des Wnt/β-Catenin-Signalwegs kann zu Wachstums- und Entwicklungsstörungen sowie zum Auftreten, zur Migration und zur Invasion von Tumoren führen. Die Herunterregulierung von nachgeschalteten Proteinen wie MMP2 und MMP9 im Wnt/β-Catenin-Signalweg kann die Metastasierung von Tumorzellen hemmen. Im Gegensatz zur biologischen Funktion des Wnt/β-Catenin-Wegs hemmt die Aktivierung des Hippo/YAP-Wegs die Zellproliferation und fördert die Zellapoptose. In Abwesenheit von Hippo-verwandten Aktivierungsfaktoren wird nicht phosphoryliertes YAP in den Zellkern transferiert und interagiert mit dem Transkriptionsaktivierungsfaktor TEAD/TEF-Familie, um die Expression von Zielgenen zu regulieren. Extrazelluläre Stimulationssignale können Mst1/2 über einen unklaren Mechanismus aktivieren und dann andere Kernmitglieder über eine Reihe von Phosphorylierungskaskadenreaktionen phosphorylieren.
Daher wird sich diese Studie auf Gebärmutterhalskrebs-Ca-Ski-Zellen konzentrieren und die Wirkungen und molekularen Mechanismen von RCE-4 auf die Proliferation, Invasion und Migration von Gebärmutterhalskrebs durch die Wnt/β-Catenin- und Hippo/YAP-Signalwege untersuchen, was eine theoretische Unterstützung für die zukünftige klinische Anwendung von RCE-4 darstellt.

Unser Labor hat durch MTT-Experimente gezeigt, dass RCE-4 die Vermehrung von Ca-Ski-Zellen in einer zeit- und dosisabhängigen Weise hemmen kann. Die Ergebnisse der Klonbildung Experiment in dieser Studie weiter zu validieren, die Wirksamkeit von RCE-4. Darüber hinaus wurde die Wirkung von RCE-4 auf die Invasion und Migration von Ca-Ski-Zellen durch Scratch-Experimente und Transwell-Kammer in vitro Invasion Experimente erkannt. Die Ergebnisse zeigten, dass RCE-4 signifikant die Migration und Invasion Fähigkeit von Ca Ski Zellen gehemmt, und ausgestellt Konzentration Abhängigkeit.
Der Wnt/β-Catenin-Signalweg spielt eine wichtige Rolle bei der Tumormigration, und der Eintritt von β-Catenin in den Zellkern ist der Schlüssel zur Aktivierung dieses Weges. Die Ergebnisse zeigten, dass RCE-4 den Eintritt von β-Catenin in den Zellkern über drei Wege hemmen kann: Hemmung der Expression von p-GSK3-β, Förderung der Phosphorylierung von β-Catenin und Hemmung der Expression von PAK4, wodurch die Transkription von nachgeschalteten Genen wie den Matrix-Metalloproteinasen MMP2/7/9/14 gehemmt wird. Interessanterweise hat die neueste Forschung herausgefunden, dass die Hemmung der Aktivität von PAK4 die therapeutische Wirkung der PD-1-Immunblockade-Therapie synergistisch verstärken kann. Die PD-1-Therapie ist wenig wirksam, wenn es keine Vorinfiltration von Immunzellen in das Tumorgewebe gibt, was auch der Hauptgrund für die Entwicklung einer Resistenz gegen die PD-1-Therapie ist. Der Einsatz von PAK4-Inhibitoren kann das Ansprechen von Tumorgewebe auf eine PD-1-Blockade-Therapie in vivo deutlich verbessern. In Anbetracht der signifikanten hemmenden Wirkung von RCE-4 auf PAK4 eröffnet uns dies eine neue Forschungsrichtung.
Der Zusammenhang zwischen dem Hippo/YAP-Signalweg und der Invasion von Tumorzellen wurde ebenfalls bestätigt, aber bisher gibt es nur relativ wenige Medikamente, die auf den Hippo/YAP-Signalweg abzielen. Im Jahr 2018 fanden Gill et al. heraus, dass es eine spezielle positive Rückkopplungsschleife um den Eintritt von YAP/TAZ-Molekülen in den Zellkern gibt, die aus fünf Proteinmolekülen besteht: NUAK2, LATS1, p-LATS1, YAP/TAZ im Zytoplasma und im Zellkern. NUAK2 kann die Expression von LATS1 hemmen, um seine Phosphorylierung zu verhindern, und so den Transfer von Molekülen des YAP/TAZ-Komplexes vom Zytoplasma in den Zellkern fördern. YAP/TAZ-Moleküle, die in den Zellkern gelangen, binden an NUAK2-Transkripte, und das transkribierte NUAK2 gelangt in das Zytoplasma, wodurch eine positive Rückkopplungsschleife entsteht. Die Entdeckung dieses Zyklus macht den Hippo/YAP-Signalweg komplexer und erklärt die Schwierigkeit, den Hippo/YAP-Signalweg zu regulieren, um die Invasion von Tumorzellen zu verhindern. Die Ergebnisse dieses Experiments zeigten, dass RCE-4 den Eintritt von YAP/TAZ in den Zellkern über mehrere Wege hemmen kann, einschließlich der Hemmung der Phosphorylierung von MST1, der Verstärkung der Phosphorylierung von YAP und der Verringerung der Expression von YAP. Die Verringerung von YAP/TAZ im Zellkern führt zu einem Rückgang der Expression von NUAK2 und unterbricht damit diese positive Rückkopplungsschleife. Die Unterbrechung des Zyklus führt zu einem Rückgang der Expression von nachgeschalteten Proteinen wie dem interzellulären Adhäsionsmolekül-1 (ICAM-1), dem vaskulären Zelladhäsionsmolekül-1 (VCAM-1), CYR61 und SOX2, wodurch die Migrationsfähigkeit von Ca-Ski-Zellen erheblich gehemmt wird.
Es ist erwähnenswert, dass die Wnt/β-Catenin- und Hippo/YAP-Signalwege in Zellen nicht völlig unabhängig voneinander sind und auf vielfältige Weise interagieren. Zum Beispiel kann phosphoryliertes YAP/TAZ an β-Catenin binden, wodurch es im Zytoplasma verbleibt und seine Transkriptionsaktivität hemmt. YAP kann die Inaktivierung von GSK3 β induzieren, was wiederum das zytoplasmatische β-Catenin stabilisiert und den Kerntransfer von β-Catenin fördert. In dieser Studie wurde die gegenseitige Rückkopplungsregulation der beiden Signalwege noch nicht eingehend untersucht. Gleichzeitig hat dieser Stand der Forschung auch gewisse Einschränkungen. Sie wurde nicht für andere Gebärmutterhalskrebs-Zelllinien wie Hela und SiHa validiert, und es fehlen tierexperimentelle Ergebnisse. Dies ist auch unsere nächste Forschungsrichtung.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass RCE-4 eine gute Fähigkeit hat, die Invasion und Migration von Ca-Ski-Zellen zu hemmen. Sein molekularer Mechanismus wird hauptsächlich durch die Blockierung des Schlüsselschritts von β-Catenin und YAP/TAZ in den Zellkern erreicht, wodurch die Aktivierung des Wnt/β-Catenin-Signalwegs gehemmt und der Hip po/YAP-Signalweg aktiviert wird.