Analyse der Zusammensetzung und der Unterschiede der endophytischen Bakteriengemeinschaften in verschiedenen Ruhephasen von Qianghuo-Samen
Notopterygium incisum Ting ex H. T. Chang ist eine Pflanzenart aus der Familie der Doldenblütler. Ihre getrockneten Rhizome werden als Medizin verwendet und sind in der traditionellen chinesischen und tibetischen Medizin, die gemeinhin als schwarze Medizin bekannt ist, weit verbreitet. Die Marktnachfrage ist groß. Gegenwärtig stammt Qianghuo hauptsächlich aus Wildbeständen und ist hauptsächlich in Strauchgrasgebieten in einer Höhe von 3000-4500 m in Sichuan, Gansu, Qinghai und anderen Orten verbreitet. In den letzten Jahren hat die übermäßige Ausgrabung große Schäden an der ökologischen Umwelt verursacht, und die wilden Qiang-Lebensressourcen gehen langsam zur Neige. Daher ist eine künstliche Domestizierung und Kultivierung dringend erforderlich.
Wenn die Samen von Qianghuo reifen und landen, ist die Entwicklung des Embryos unvollständig, und es gibt oft keinen Embryo oder ein primitives Embryo-Phänomen. Es hat eine doppelte Keimruhe in Bezug auf Morphologie und Physiologie und gehört zu den Samen mit tiefer Keimruhe. Die Keimungsrate von Qianghuo-Samen in natürlicher Umgebung ist extrem niedrig (0,52%). Die derzeitige wirksame Methode zur Überwindung der Keimruhe von Qianghuo-Samen ist die GA-Methode mit Sandlagerung bei variabler Temperatur. Zunächst wird die morphologische Keimruhe durch eine Sandlagerung bei warmen Temperaturen aufgehoben, und dann ist eine Sandlagerung bei niedrigen Temperaturen erforderlich, um die physiologische Keimruhe aufzuheben, bevor die Samen keimfähig sind. Die Dauer der Saatgutbehandlung kann mehr als 8 Monate betragen. Bei Anwendung dieser Methode zur Behandlung von Qianghuo-Saatgut liegt die höchste Keimrate bei 21,2%. Darüber hinaus beträgt der Wachstumszyklus von Qianghuo-Heilkräutern über 4 Jahre, und aufgrund des langen Investitionszyklus und der langsamen Wirksamkeit ist die Entwicklung des künstlichen Anbaus sehr langsam. Gegenwärtig ist nur ein sporadischer Anbau möglich, der den Anforderungen einer nachhaltigen Entwicklung des Qianghuo-Marktes nicht gerecht wird. Die Technologie zur manuellen Aufhebung der Keimruhe von Qianghuo-Saatgut hat in den letzten zehn Jahren keine bahnbrechenden Fortschritte gemacht, was eines der Hauptprobleme ist, die den großflächigen Anbau von Qianghuo behindern.
Endophytische Bakterien in Pflanzen beziehen sich auf Pilze oder Bakterien, die in verschiedenen Geweben und Organen gesunder Pflanzen in bestimmten oder allen Phasen ihres Lebenszyklus leben. Sie gehen mit der Wirtspflanze eine komplexe und spezielle wechselseitige Beziehung ein und fördern die Zellteilung, die Wurzelentwicklung und das Wachstum der Keimlinge, indem sie den Stoffwechsel von Auxin und Mitogenen in der Pflanze steigern. Die Keimruhe wird durch das Gleichgewicht zwischen Gibberellin-Wachstumsförderern und Abscisinsäure-Wachstumshemmern gesteuert. Die Forschung hat herausgefunden, dass endophytische Bakterien die Samenruhe regulieren können, indem sie die Synthese endogener Hormone in Pflanzen regulieren oder induzieren, was eine theoretische Grundlage für die Erforschung endophytischer Bakterienressourcen mit wachstumsfördernden Funktionen in Samen darstellt. Pu Fengya et al. fanden heraus, dass endophytische Bakterien in Hiobstränen die Keimungsrate von Hiobstränen, Reis- und Weizensamen erhöhen und das Wachstum von Sämlingen durch die Anregung des Wurzelwachstums fördern können. Lei Ruifeng entdeckte, dass endophytische Bakterien in den Samen der Silbersandheuschrecke die Keimung der Samen fördern, indem sie den Samenstoffwechsel regulieren. Xiang Yiqing und andere fanden heraus, dass endophytische Bakterien in Huanglian-Samen die Keimungsrate von Huanglian-Samen erheblich verbessern können. Die endophytischen Bakterien von Sichuan-Pfeffer (Capsicum annuum), Reis (Oryza sativa L.) und Dendrobium catenatum fördern direkt das Wachstum und die Entwicklung der Wirtspflanzen, indem sie endogene Hormone wie Auxin, Abscisinsäure, Cytokinin, Gibberellinsäure usw. ausschütten. Die endophytischen Bakterien, die aus den Samen von Achnatherum inebrians, Dendrobium nobile und Lolium rigidum isoliert wurden, sowie die endophytischen Bakterien, die aus den Wurzeln von Polygonatum multiflorum L. isoliert wurden, regulieren die Keimruhe der Samen, indem sie endogene Hormone wie Cytokinin absondern, wodurch sich ihre Keimungs- und Überlebensraten deutlich verbessern. Können die endophytischen Bakterien in Qianghuo-Samen jedoch die Aufhebung der Keimruhe fördern, indem sie das Wachstum des Embryos begünstigen? Ausgehend davon werden in diesem Experiment Qianghuo-Samen als Forschungsobjekt verwendet und die kulturfreie Hochdurchsatz-Sequenzierungstechnologie Illumina MiSeq eingesetzt, um die Zusammensetzung und die Unterschiede der endophytischen Bakteriengemeinschaften in verschiedenen Ruhezuständen von Qianghuo-Samen zu untersuchen. Dies bietet eine theoretische Grundlage für weitere Forschungen über den Einsatz von Mikroorganismen zur Aufhebung der Keimruhe von Qianghuo-Samen und liefert auch wichtige theoretische Hinweise für den Anbau von Pflanzen mit ähnlichen Keimruheeigenschaften.

Als wichtiges Fortpflanzungsorgan der Pflanzen kann das Saatgut als Medium für die Übertragung nützlicher Mikroorganismen von der Mutterpflanze auf die nächste Generation durch vertikale Vermehrung dienen und so die Keimung der Samen und das Wachstum der Sämlinge fördern. Endophytische Bakterien in den Samen von Gräsern wie Reis und Mais spielen eine wichtige Rolle bei der Keimung der Samen, dem Wachstum und der Entwicklung der Sämlinge und dem Wachstum der Wirtspflanzen. Die Samen von Dendrobium nobile Lindl. reifen nach und haben kein Endospermgewebe, so dass für die Keimung eine Symbiose mit Mikroorganismen erforderlich ist. Die dominierenden endophytischen Bakterien sind hauptsächlich Proteobakterien und Cyanobakterien. Diese Studie ergab, dass Qianghuo-Samen drei verschiedene Ruhezustände aufweisen und die Arten der endophytischen Bakteriengemeinschaften auf Phylum-Ebene ähnlich sind. Die endophytischen Bakterien setzen sich hauptsächlich aus Proteobakterien, Actinobakterien und Firmicutes zusammen, was mit den vorherrschenden endophytischen Bakterienphyla anderer Pflanzensamen übereinstimmt. Im Vergleich zu den Samen von Dendrobium officinale ist die vorherrschende endophytische Bakterienpyla jedoch anders. Die Arten der Pflanzensekrete und die Fähigkeit der Mikroorganismen, Samen zu kolonisieren, zu überleben und sich in ihnen auszubreiten, sind unterschiedlich, was zu Unterschieden bei den endophytischen Bakterien in verschiedenen Pflanzensamen führt. Da die endophytischen Bakterien in den Samen aus verschiedenen Pflanzenorganen oder meristematischen Geweben stammen, übertragen und kolonisieren sie den Samenembryo und das Endosperm durch Mikrotubuli-Verbindungen oder Gameten und verbreiten sich vertikal. Die Samen der Heilpflanzen Qianghuo und Dendrobium officinale keimen aufgrund ihrer Keimruhe nur schwer. Studien haben jedoch ergeben, dass die vorherrschenden endophytischen Bakteriengruppen der beiden Pflanzen Unterschiede aufweisen, was auf die unterschiedlichen Quellen der endophytischen Bakterien zurückzuführen sein könnte. Die Samen von Qianghuo ruhen aufgrund der unvollständigen Embryonalentwicklung, und ihre endophytischen Bakterien stammen hauptsächlich aus dem Endosperm, während die Samen von Dendrobium officinale aufgrund des fehlenden Endosperms ruhen. Ihre endophytischen Bakterien stammen hauptsächlich aus dem Embryo, so dass es Unterschiede in den Stammtypen zwischen den beiden gibt. Es wird vermutet, dass auch die Qianghuo-Samen mit Mikroorganismen koexistieren müssen, um zu keimen. Eine geringe Menge endophytischer Bakterien, die zum Stamm der Bacteroidetes gehören (2,01%), erschien in den Samen von Qianghuo im GSC-Zustand, während unbekannte endophytische Pilze, die zum Stamm der Bacteroidetes gehören, in 24,33% und 7,74% der Samen im GSB- bzw. GSC-Zustand erschienen. Diese endophytischen Bakterien könnten eine wichtige Rolle bei der Förderung des Wachstums des Samenembryos und der Aufhebung der Keimruhe spielen und werden im Mittelpunkt künftiger Forschungsarbeiten stehen. Endophytische Pilze kommen in den Samen vieler Pflanzen in großer Zahl und Vielfalt vor. Die endophytischen Pilze in Qianghuo-Samen bestehen hauptsächlich aus Ascomycota und Basidiomycota, was mit den vorherrschenden endophytischen Pilzen in Phaseolus vulgaris L.-Samen und Dendrobium nobile-Samen übereinstimmt.

Auf der Ebene der Gattungen ändert sich die Zusammensetzung der endophytischen Bakteriengemeinschaften zwischen GSA und GSB, und die Arten der endophytischen Bakteriengemeinschaften sind zwischen GSB und GSC ähnlich. Die Analyse der Alpha-Diversität ergab, dass die Vielfalt der endophytischen Bakterien in GSA deutlich geringer war als in GSB und GSC, während es keinen signifikanten Unterschied in der Vielfalt der endophytischen Bakterien zwischen GSB und GSC gab. Der Hauptgrund dafür könnte sein, dass im GSA-Zustand der Stamm der Proteobakterien mit 97,08% einen absoluten Vorteil hatte und dadurch das Wachstum anderer Bakterien hemmte. Im Gegensatz dazu befanden sich die Samen im GSB- und GSC-Zustand lange Zeit in einer relativ hypoxischen Umgebung, was zu einem relativ geringeren Wettbewerb zwischen den Mikroorganismen und keiner signifikanten hemmenden Wirkung zwischen den Mikroorganismen führte, was zu einem höheren Diversitätsindex als im GSA-Zustand führte. Es gab keinen signifikanten Unterschied in der Diversität der endophytischen Pilzgemeinschaften während des gesamten Prozesses der Freigabe der Samen aus der Dormanz. Die PCoA-Analyse der Beta-Diversität ergab, dass sich die Struktur der Gemeinschaft endophytischer Bakterien vom GSA- zum GSB- und dann zum GSC-Zustand signifikant veränderte, während sich die Struktur der Gemeinschaft endophytischer Pilze vom GSA- zum GSB-Zustand nicht signifikant veränderte, bis die physiologische Dormanz der Samen aufgehoben war. Qianghuo-Samen reifen und landen und keimen erst nach einer langfristigen Stratifikationsbehandlung bei warmen und niedrigen Temperaturen. Während dieses Zeitraums verändert sich die Struktur der endophytischen Bakteriengemeinschaft in den Samen, was darauf hindeutet, dass dies einer der Haupteinflussfaktoren für die Keimfähigkeit der Qianghuo-Samen ist, dessen Wirkungsmechanismus weiter erforscht werden muss.
Die Rolle der endophytischen Bakterien in Pflanzensamen ist noch nicht geklärt, aber zahlreiche Studien haben gezeigt, dass endophytische Bakterien regulierende Auswirkungen auf Wirtspflanzen und Samen haben. Die endophytischen Bakterien in Weidelgras können Cytokinine produzieren und mit von der Pflanze produzierten Pflanzenhormonen interagieren, wodurch die Samenruhe reguliert wird. Endophytische Bakterien in Samen können auch das Pflanzenwachstum fördern, indem sie Pflanzenhormone produzieren oder die Aufnahme von Pflanzennährstoffen, insbesondere Stickstoff und Phosphor, erleichtern. In dieser Studie wurden die charakteristischen Mikroorganismen von GSA, GSB und GSC auf Gattungsebene weiter analysiert. Insgesamt gab es 15 endophytische Bakterien und keine charakteristischen Mikroorganismen in endophytischen Pilzen. Diese Mikroorganismen waren in ihren jeweiligen Dormanzstadien im Vergleich zu anderen Dormanzstadien relativ häufig und könnten eine wichtige Rolle bei der Freisetzung der morphologischen und physiologischen Dormanz von Qiangfu-Samen spielen, was sie zu einer mikrobiellen Schlüsselpopulation für zukünftige Forschungen macht. Unter ihnen sind die dominierenden Bakteriengattungen im GSA-Status Erwinia und Pseudomonas. Pseudomonas ist am Verderb vieler Früchte und Gemüse beteiligt, wobei etwa 50% bis 90% der Verderbnisbakterien Pseudomonas sind. Die Pektinsäure-Lyase und das Pektin-Methylgalacturonat-Enzym, die von Erwinia abgesondert werden, haben eine synergistische Wirkung auf die Erweichung von Pflanzengeweben, die das Pektin in der Pflanzenzellwand abbauen und die Erweichung und den Verderb verursachen können. Die Ergebnisse dieser Studie deuten darauf hin, dass frisch geerntete Qiangfu-Samen umgehend in Sand gelagert werden müssen, um Verderb zu verhindern und die Keimung der Samen zu beeinträchtigen. Huang Zhiyuan et al. stellten fest, dass die relative Häufigkeit der Gattung Erwinia in Bambussprossen von Phyllostachys nuda mit steigender Lagertemperatur abnahm. In dieser Studie wurde festgestellt, dass die Häufigkeit von frisch geernteten Qiangfu-Samen nach der Behandlung mit warmen Temperaturen (15 ℃) deutlich abnahm, was mit früheren Forschungsergebnissen übereinstimmt. Dies könnte damit zusammenhängen, dass das Endosperm der Samen einer warmen Temperatur- und Sandlagerungsbehandlung unterzogen wurde und die vorherrschenden Bakteriengattungen, die bei der Zersetzung des Endosperms auftraten, eine große Menge an Energie für die Embryonalentwicklung produzierten, was indirekt ihr Wachstum hemmte. Wenn die Qianghuo-Samen reifen und landen, hat sich der Embryo noch nicht entwickelt und muss bis zu acht Monate lang in warmem Sand gelagert werden, um seine morphologische Dormanz aufzuheben, was mit dem Vorhandensein schwer abbaubarer Keimungshemmer im Endosperm zusammenhängt. Die Gattung der Rotschwimmenden Bakterien besitzt die Fähigkeit zur Denitrifikation und ist ein funktionelles Bakterium, das organische Stoffe und einige schwer biologisch abbaubare stickstoffhaltige Verbindungen abbauen kann. Diese Studie ergab, dass die dominierenden endophytischen Bakterien im GSB-Zustand die Gattung der rot schwimmenden Bakterien und die Gattung Catellatospora sind, die möglicherweise eine Rolle beim Abbau von Keimhemmern und bei der Förderung des Embryowachstums spielen und die wichtigsten mikrobiellen Gruppen für die künftige Forschung sind. Die dominierenden Bakteriengattungen im GSC-Status sind die Gattungen Deinococcus, Steridobacterium, Rhizobium, Mucococcus, Mycobacterium, Hydrobacteria, Micromonospora, Actinobacteria, Bacillus, Flavobacterium und Myceticola. Forschungen haben ergeben, dass die Gattung Dvoras ein Stickstoff fixierendes Bakterium ist; langsam wachsende Rhizobien haben die Fähigkeit, anorganische Phosphate aufzulösen, was den Pigmentgehalt der pflanzlichen Photosynthese erhöhen kann; der Mycetocola-Stamm wurde ursprünglich auf dem Mi Dui-Gletscher entdeckt und ist ein kälteresistenter Mikroorganismus. Nachdem die Qianghuo-Samen durch Lagerung in warmem Sand aus der Keimruhe befreit wurden, sind sie nicht keimfähig. Sie müssen mit einer Kältesandlagerung behandelt werden, bevor sie keimen können. Es wird vermutet, dass das Endosperm nach Aufhebung der Keimruhe erschöpft ist und die für das weitere Wachstum des Embryos und der Embryowurzel erforderliche Energie nicht mehr liefern kann. Die Stickstoffprodukte, die durch den Abbau stickstoffhaltiger Keimhemmstoffe durch rotbewegliche Mikroorganismen während der Ruhephase entstehen, können nicht direkt vom Embryo aufgenommen werden. Sie müssen in Stickstoff umgewandelt werden, der von der Pflanze durch stickstofffixierende Mikroorganismen aufgenommen werden kann, um das Embryowachstum und den Durchbruch der Embryowurzel durch die Samenschale zu fördern. Es wird vermutet, dass stickstofffixierende Mikroorganismen mit Myceticola-Mikroorganismen zusammenarbeiten müssen, um normal zu wachsen, während Myceticola-Mikroorganismen nur in Umgebungen mit niedrigen Temperaturen normal wachsen können. Daher müssen die Qianghuo-Samen nach der Aufhebung der Keimruhe eine gewisse Zeit lang behandelt werden. Erst nach einer Behandlung bei niedrigen Temperaturen kann die embryonale Wurzel die Samenschale durchbrechen, und die Samen sind in der Lage zu keimen. Es wird vermutet, dass die charakteristischen Mikroorganismen der langsam wachsenden Rhizobien in den Embryonen im GSC-Zustand den Gehalt an photosynthetischen Pigmenten in den Embryonen erhöhen können und so die Photosynthese in den Embryonen vorbereiten.
Da Qianghuo-Samen als Prototyp-Embryonen oder ohne Embryonen reifen und landen, ist das Wachstum der Samenembryonen beim künstlichen Anbau sehr langsam, was zu einer langen Keimzeit und einem schwierigen Keimungsprozess der Qianghuo-Samen führt. In natürlichem Zustand dauert es bis zu 11 Monate, um zu keimen. Es ist dringend notwendig, Mikroorganismen zu finden, die das Wachstum der Samenembryonen fördern, um ihre morphologische und physiologische Keimruhe aufzuheben, und die die Entwicklung des künstlichen Anbaus von Qianghuo stark unterstützen. In diesem Experiment wurden die Zusammensetzung der Gemeinschaftsstruktur und die Unterschiede zwischen endophytischen Bakterien und Pilzen in verschiedenen Dormanzzuständen von Qiangfu-Samen durch kultivierungsfreie Hochdurchsatz-Sequenzierungsmethoden eingehend untersucht. Die charakteristischen Mikroorganismen der einzelnen Ruhezustände wurden analysiert. Diese Arbeit liefert eine neue Idee für den Einsatz mikrobieller Methoden zur Aufhebung der Keimruhe von Qiangfu-Samen, füllt die Lücke im Forschungsbereich der mikrobiellen Förderung der Aufhebung der Keimruhe von Samen und legt den Grundstein für die weitere Nutzung dieser potenziellen endophytischen bakteriellen Ressourcen, die die Aufhebung der Keimruhe fördern, um die Keimungsrate von Qiangfu-Samen zu verbessern und ihre standardisierte Entwicklung im künstlichen Anbau zu fördern. Es wird erwartet, dass sie eine theoretische Anleitung für den Einsatz mikrobieller Methoden wie die Entwicklung von Stämmen oder mikrobiellen Präparaten zur schnellen Aufhebung der Keimruhe bietet.