Shanna fenol, AMPK/NOX4 yolunu düzenleyerek glomerüler mezangiyal hücrelerde yüksek glukoz kaynaklı oksidatif stresi ve hücre dışı matris birikimini engeller
Diyabet nefropatisi (DN) diyabetin mikrovasküler bir komplikasyonudur ve son dönem böbrek yetmezliğinin önemli bir nedenidir. Glomerüler mezangial hücrelerin (GMC'ler) anormal fonksiyonu diyabetik nefropatide patolojik ve fizyolojik değişiklikleri teşvik edebilir. Renal patolojik koşullar altında, uzun süreli hiperglisemi vücutta büyük miktarda reaktif oksijen türünün (ROS) birikmesine yol açar, bu da aşağı akış glikoz sinyal yanıtlarını aktive eder, hücre dışı matris (ECM) birikimini teşvik eder ve GMC'lerin anormal proliferasyonunu doğrudan uyarır. Bu durum, GMC'lerde oksidatif stres (OS) ve ECM birikimine müdahale etmenin diyabetik nefropatiyi önlemek için etkili bir strateji olabileceğini düşündürmektedir.

DN'nin birden fazla patogenez mekanizması vardır ve bunlar arasında OS, yüksek ROS seviyelerinin neden olduğu DN'de önemli bir patojenik faktördür. İndirgenmiş nikotinamid adenin dinükleotid fosfat (NADPH) ailesi (NOX 1-5 ve Duox 1-2), DN'deki ana ROS kaynaklarından biri olan ROS üretmek için plazma membranı yoluyla elektronları oksijen moleküllerine aktarır. NADPH oksidaz 4 (NOX4), DN hastalarının böbreklerinde yüksek oranda eksprese edilen bir NADPH alt tipidir ve GMC'lerde yüksek glikoz kaynaklı OS üretiminin ana nedenidir. Yüksek NOX4 seviyeleri doğrudan glomerüler fibrozise neden olabilir. NOX4 ekspresyonunun susturulması glomerüler membran dilatasyonunu, glomerülosklerozu ve ECM birikimini zayıflatacaktır. NOX4 ekspresyonunun yüksek glukozla indüklenen upregülasyonunun moleküler mekanizmasının ve ilgili yukarı ve aşağı yönlü efektör faktörlerin ortaya çıkarılması büyük önem taşımaktadır.

5'- adenozin monofosfat ile aktive edilen protein kinazların (AMPK) fosforilasyonu, yüksek glikozun indüklediği NOX4 ekspresyonunu bloke edebilir ve renal fibroblastların anormal proliferasyonunu ve aktivasyonunu inhibe edebilir. Sestrinler, hücresel çevresel stabilitenin korunmasında çok önemli bir rol oynayan, stresle indüklenen önemli bir protein ailesidir. Sestrin2 ailenin en önemli üyelerinden biridir ve AMPK fosforilasyonunu aktive ederek hücrelerin oksidatif hasardan korunmasında kritik bir rol oynar. Ek olarak, AMPK, NOX aktivasyonunun negatif bir düzenleyicisi olabilir, çünkü Sestrin2 ve AMPK aktivasyonu ROS'u inhibe edebilir ve GMC'leri OS istilasından koruyabilir, bu da Sestrin2 ve AMPK fosforilasyonunun aktivasyonunun DN üzerinde önleyici bir etkiye sahip olabileceğini gösterir.

OS ve ECM birikiminin diyabetik nefropatinin patogenezinde önemli bir rol oynadığı kanıtlanmıştır, bu nedenle antioksidan etkileri olan ve DN etkilerini zayıflatan geleneksel Çin tıbbı ve doğal ürünlerin araştırılması özellikle acildir. Flavonoidler, mükemmel etkinlikleri nedeniyle akademisyenlerin artan ilgisini çekmiştir. Kaempferol (KAE), çoklu farmakolojik aktivitelere sahip olduğu kanıtlanmış bir flavonoid bileşiğidir. KAE, enflamatuar yanıtı ve OS'yi inhibe ederek yüksek kan şekerinin neden olduğu kalp hasarını azaltır; RhoA/Rho kinaz aracılı enflamatuar sinyali inhibe ederek DN iyileştirilebilir. Şu anda, KAE'nin AMPK/NOX4 yolunu düzenleyerek yüksek glikoz kaynaklı GMC'lerin OS ve ECM birikimine müdahalesi üzerine nispeten az araştırma vardır. Bu çalışmada, KAE'nin yüksek glikozun indüklediği GMC'lerde OS ve ECM birikimi üzerindeki etkilerini ve DN'ye karşı koruyucu mekanizmasını araştırmak için in vitro yüksek glikoz GMC modeli kullanılmıştır.

Yüksek kan glukoz seviyesi, diyabet nefropatisinde böbrek fonksiyonu ve patolojik değişikliklerin temel faktörü olarak kabul edilmektedir. HG ortamında kültüre edilen mezangiyal hücreler ile DN hastaları arasındaki fenotip benzerliği nedeniyle, bu deneyde KAE'nin HG kaynaklı GMC hasarı üzerindeki koruyucu etkisini in vitro olarak araştırdık. Sonuçlar, KAE'nin AMPK/NOX4 yolağını düzenleyerek HG kaynaklı GMC hücre proliferasyonunu, OS ve ECM birikimini inhibe ettiğini gösterdi.

DN'nin erken karakteristikleri mezangial hücrelerin anormal proliferasyonu ve genellikle mezangial proliferasyona, renal fibrozise ve son dönem böbrek hasarına yol açan aşırı ECM birikimidir. Kolajen, fibronektin (FN) ve laminin ECM'nin ana bileşenleridir ve esas olarak yüksek kan glukozu uyarımı altında sentezlenirler. DN'de, TGF - β 1 renal ECM birikiminde rol oynayan önemli bir sitokindir. Normal fizyolojik koşullar altında, vücuttaki çeşitli hücreler inaktif TGF - β 1 salgılayabilir; yüksek glikoz ortamında, inaktif TGF - β 1 aktif bir duruma dönüştürülebilir, ECM genlerinin (Col IV gibi) ekspresyonunu artırarak ve ECM degradasyonunu azaltarak glomerüler ECM birikimini teşvik edebilir. TGF - β 1'in inhibe edilmesi, ECM gen ekspresyonunda yüksek glukozun neden olduğu değişiklikleri zayıflatabilir ve böylece DN'de ECM birikimini azaltabilir. Sonuçlar, yüksek glikozla uyarılmış GMCs hücrelerinde, TGF - β 1 ve Col IV'ün mRNA ve protein seviyelerinin önemli ölçüde arttığını, KAE tedavisinin ise bunların ekspresyonunu azaltabildiğini göstermiştir; bu da KAE'nin ECM birikimini azaltarak ve bozunmasını teşvik ederek diyabet karşıtı bir rol oynayabileceğini göstermektedir.

DN'nin patogenezi, hücreler içinde çoklu sinyal yollarını aktive edebilen ve transkripsiyon faktörlerini uyararak ECM birikiminin artmasına ve matris yıkımının azalmasına yol açan OS oluşumuyla ilgilidir. HG kaynaklı ROS üretimi, oksidanlar ve antioksidanlar arasındaki dengeyi bozabilir, antioksidan savunma sistemlerine müdahale edebilir ve GMC'lerde hasara yol açabilir. Buna dayanarak, aşırı ROS üretimi diyabetik nefropatinin patogenezinde önemli bir rol oynamaktadır. Patolojik koşullar altında, ROS temizlenmesi SOD ve MDA gibi enzimatik ve enzimatik olmayan sistemlerin ortak katılımını gerektirir. SOD, süperoksit anyonlarının ve hidrojen peroksitin dismutasyonunu katalize ederek oksidasyon ve antioksidasyon arasındaki dengenin korunmasında önemli rol oynayan bir antioksidan metaloenzimdir. MDA seviyeleri GMC'lerdeki membran lipid peroksidasyon seviyeleri ile doğrudan ilişkili olduğundan, MDA'nın antioksidan savunma sistemi üzerinde bir etkisi vardır. Sonuçlar, KAE'nin HG ile indüklenen GMC'lerde SOD aktivitesini artırabileceğini ve MDA içeriğini azaltabileceğini göstermiştir, bu da KAE'nin potansiyel antioksidan özelliklere sahip olduğunu göstermektedir.

ROS iletimi ve artmış glukoz sinyali, diyabetik nefropatinin gelişimini destekleyen önemli patojenik faktörler olarak kabul edilmektedir. Böbrekte birçok ROS kaynağı vardır ve NOX ailesinin NADPH oksidaz alt tipi esas olarak diyabet nefropatisi ile ilişkilidir. Şimdiye kadar yapılan çalışmalarda NOX ailesinin yedi alt tipi bulunmuştur; bunlar arasında NOX4 sıçan ve fare glomerüllerinde, podositlerde ve tübüler hücrelerde yüksek oranda ifade edilmektedir. Normalde NOX4, biyolojik işlevinden sorumlu olan aktif bir kompleks oluşturmak için transmembran alt birimine (p22phox) bağlanır. NOX4'ün yukarı regülasyonu, HG'ye maruz kalan mezangiyal hücreler ve tübüler hücrelerde FN ve TGF - β 1 artışı ile ilişkilidir. NOX4, fibroblastlarda TGF - β 1 ile indüklenen ECM birikimi ile ilişkilidir ve bu da fibrotik fibroblast fenotiplerine farklılaşmalarına katkıda bulunur. NOX4'ün anjiyotensin II tedavisi altında mezangiyal hipertrofi ve FN artışına aracılık ettiği gösterilmiştir. OS ve ECM'nin aşırı birikimi böbrek hasarına yol açabilir ve DN'nin önemli bir nedeni olarak kabul edilir. OS, ECM birikimi ve NOX arasındaki ilişkiyi araştırmak için, DN'de yüksek oranda ifade edilen NOX4 alt tiplerinin protein ve mRNA seviyelerini ölçmek için Western blot ve qRT PCR kullanılmıştır. Araştırmalar NOX4 aktivitesinin ortadan kaldırılmasının HG ile indüklenen GMC'lerde OS ve ECM'de azalmaya yol açtığını göstermiştir. Bu deneyin sonuçları önceki çalışmalarla tutarlıdır. HG, NOX4 ve p22phox'un mRNA ve protein ekspresyonunu artırarak GMC'lerde ROS, TGF - β 1 ve Col IV oluşumunu uyarır. KAE kullanımı ve NOX4 ve p22phox'un susturulması OS ve ECM birikimini engelleyebilir, bu da KAE'nin antioksidan etkisinin NOX4/p22phox yolu üzerinden düzenlendiğini gösterir.

Sestrins ailesi, antioksidan savunma mekanizmalarından biri olan ve iki farklı biyolojik aktivite işlevine sahip olan hücre içi stabilite düzenlemesinde yer alan bir grup stres kaynaklı proteinden oluşur. İlk olarak, antioksidan etkiler göstermek için ROS birikimini inhibe etmek, antioksidan transkripsiyon faktörlerini düzenlemeyi içerebilir. İkinci olarak, Sestrinler AMPK'yı aktive ederek veya Rag GTPazları inhibe ederek mTORC1'in geri bildirim inhibitörleri olarak hareket ederler. AMPK, neredeyse tüm ökaryotik hücrelerde yaygın olarak ifade edilen önemli bir metabolik sensördür. Araştırmalar, HG koşulları altında, Sestrin2 ve AMPK aktivasyonunun GMC'lerde NOX4 kaynaklı ROS birikimini engellediğini göstermiştir. AMPK fosforilasyonu, insan mezangiyal hücrelerinde ROS üretimini ve ECM birikimini inhibe eder. Ayrıca, AMPK fosforilasyonu idrarda TGF - β 1 birikimini inhibe edebilir, mezanjiyal matris genişlemesini baskılayabilir ve DN fare modellerinde kolajen birikimini azaltabilir. Giderek daha fazla çalışma AMPK'nın DN'deki NOX aktivitesi ile yakından ilişkili olduğunu göstermektedir. Bu deneyde, KAE'nin AMPK'yı yukarı doğru düzenleyerek HG kaynaklı hücre çoğalmasını, ROS üretimini, NOX4, TGF - β 1 ve Col IV ekspresyonunu önemli ölçüde inhibe ettiği bulunmuştur. Ek olarak, bileşik C, KAE'nin GMC'lerde HG kaynaklı OS ve ECM birikimi üzerindeki koruyucu etkisini tersine çevirmiştir.

Özetle, bu çalışma KAE'nin AMPK/NOX4 yolunu düzenleyerek HG kaynaklı GMCs OS ve ECM birikimi üzerinde koruyucu bir etki gösterdiğini ortaya koymaktadır. KAE'nin DN'nin önlenmesi ve tedavisi için potansiyel bir aday ilaç veya öncü bileşik olarak hizmet etmesi beklenmektedir.