İnsan serviks kanseri HeLa hücrelerinde Leukamenin E kaynaklı sitoplazmik hücre iskeleti yeniden düzenlenmesi ve migrasyon inhibisyonu üzerine çalışma
Ökaryotik hücrelerdeki mikrofilamentler, mikrotübüller ve ara lifler, sitoplazmik iskelet sistemi gibi oldukça düzenli üç boyutlu bir ağ oluşturmak için bağlayıcı proteinleri ile birbirine bağlanır. Materyal taşıma, bilgi aktarımı, hücre bölünmesi, hücre göçü ve hücre morfolojisinin korunması gibi temel hücresel yaşam süreçlerine katılırlar. Hücre iskeletinin dinamik süreci, hücresel yaşam faaliyetlerinin ihtiyaçlarını karşılamak için yüksek oranda düzenlenir ve montaj bozukluğu hücre büyümesinin engellenmesine, hücre bölünmesinin durmasına ve hatta hücre apoptozuna yol açabilir. Bazı anti-tümör ilaçlar, hücre iskeletinin depolimerizasyonunu ve polimerizasyonunu değiştirerek mikrotübüllerin dinamik dengesini bozabilir, böylece hücre çoğalmasını engelleyebilir ve anti-tümör etkiler uygulayabilir. Bitkiden elde edilen antikanser ilaçları kataranthus alkaloidleri ve taksanlar β - tubulin ile birleşebilir, mikrotübül iskeletinin dinamik sürecine müdahale edebilir ve meme kanseri, akciğer kanseri, nöroblastom, rabdomyosarkom, akut lösemi vb. dahil olmak üzere çeşitli tümörleri tedavi etmek için kullanılabilir. Hücre iskeletini ve ilgili proteinlerini hedef alan anti-tümör ilaçların araştırılması ve keşfi, çok aktif bir sınır araştırma alanı haline gelmiştir.

Reaktif oksijen türleri (ROS), hücreler içinde sinyal molekülleri olarak hareket eder ve hücre çoğalması ve farklılaşması gibi başlıca hücresel yaşam süreçlerine katılır. Tümör hücrelerinde metabolik yollardaki değişiklikler nedeniyle, ROS içeriği, özellikle H2O2 artar ve bu da tümör hücrelerini ROS seviyelerindeki değişikliklere karşı daha hassas hale getirir. Bu nedenle, ROS üretimi ve antioksidan savunma ile hücre içi bileşenlerin spesifik modifikasyonları kanser tedavisi için hedef olarak tanımlanmıştır. Araştırmalar, NADPH oksidaz ve diğer kaynaklar tarafından üretilen ROS'un mikrofilamentleri, mikrotübülleri ve ara ipek proteinlerini doğrudan değiştirebildiğini, dinamik montaj sökme süreçlerini etkileyebildiğini veya ilgili sinyal yolları aracılığıyla Rho GTPaz'ı yukarı yönde aktive ederek hücre iskeletini yeniden şekillendirebildiğini göstermiştir. NADPH oksidaz aracılı hücre içi oksidatif stres de hücre iskeletiyle ilgili hastalıklarda önemli bir düzenleyici rol oynamaktadır. Son yıllarda, araştırmacılar ROS'un hücre iskeleti dinamiklerinin düzenlenmesindeki rolüne yaygın bir ilgi göstermişlerdir.

Camellia cinsinde Çin'de dağılmış 90'dan fazla bitki türü vardır ve bunların yaklaşık 30'u tıbbi amaçlarla kullanılmaktadır. Bunlar arasında Isodon rubescens bir zamanlar Çin Farmakopesi'ne dahil edilmiştir ve esas olarak antibakteriyel, anti-enflamatuar ve anti-tümör hastalıklarının tedavisinde kullanılmaktadır. Lonicera japonica'nın ana aktif bileşeni olan Oridonin, anti-tümör mekanizması için kapsamlı bir şekilde incelenmiş ve yapısal modifikasyonları, anti lösemi ilaçları olarak faz I klinik denemelerine girmiştir. Özellikle Camellia cinsindeki bitkilerin dallarında ve yapraklarında bol miktarda bulunan 1300'den fazla enantiyomerik kaempferol diterpen türü keşfedilmiştir. Bu bileşikler kapsamlı antikanser aktivitesi sergilemektedir ve yeni anti-tümör ilaçların keşfine yol açmaları beklenmektedir. Şu anda, arbutin gibi sadece çok az sayıda enantiyomerik diterpen, antikanser mekanizmaları açısından kapsamlı ve sistematik bir şekilde incelenmiştir. Bu türden diğer diterpenler üzerinde hala ilgili araştırma eksikliği vardır, ancak son yıllarda önemli ilerlemeler kaydedilmiştir. Son yıllarda, kaempferol diterpenlerin bazı enantiyomerlerinin hücre iskeleti sistemi üzerinde etkili olabileceği ve antikanser aktivite gösterebileceği bulunmuştur. Örneğin, bakteriyosin A, iğ düzeneği kontrol noktasını etkinleştirmek için doğrudan BubR1 proteinini hedefler, ortadan geç hücre geçişini önler ve lösemi hücreleri Raji ve Jurkat'ın mitotik fazını inhibe eder; Wangzaozin A ve epinodosin, sırasıyla HeLa ve HL-60 hücrelerinde hücre iskeletinin (mikrofilamentler, mikrotübüller ve ara filamentler) yeniden düzenlenmesini indükler ve bu da hücre farklılaşmasını indüklemeleriyle ilişkilidir; Leukamenin E ayrıca HUVEC'lerde ve PLC hücrelerinde keratin fosforilasyonunu indükleyebilir, böylece keratin lif ağlarının normal montajını engelleyebilir. Bu makale, lökamenin E'nin HeLa hücrelerinde üç iskelet lifinin (mikrofilamentler, mikrotübüller ve keratin lifleri) yeniden düzenlenmesi üzerindeki etkilerinin yanı sıra hücre büyümesi ve migrasyon inhibisyonunun olası mekanizmalarını rapor etmeye devam etmektedir. Enantiyomerik kaempferol diterpenoidlerin antikanser moleküler mekanizmalarının aydınlatılması için ipuçları ve bu bileşiğin daha da geliştirilmesi ve uygulanması için bilimsel temel sağlar.

Son yıllarda, enantiyomerik kaempferol diterpenlerin antikanser farmakolojik aktivitesi araştırmacılar arasında yaygın bir ilgi görmüştür. Farklı moleküler konfigürasyonlara sahip bu bileşiklerin antikanser mekanizmaları hakkında artan raporlar bulunmaktadır ve hücresel yaşam süreçleri üzerindeki etkilerinin çok yönlü olduğu ve moleküler düzeyde çok hedefli etkiler gösterdiği tespit edilmiştir. Örneğin, çeşitli hücresel sinyal yolları aracılığıyla hücre apoptozunu ve farklılaşmasını indükleyerek; peroksidaz I ve II, BubR1 proteini ve kanser proteini AML1-ETO'yu hedef alarak, NADPH oksidaz aktivitesini düzenleyebilir ve keratin fosforilasyonunu indükleyebilir. Araştırma grubumuz, enantiyomerik kaempferol diterpenlerin hücre iskeleti sistemi üzerindeki etkilerini art arda rapor etmiştir: lökamenin E, hücre keratini K8 ve K18'in fosforilasyonunu indükleyebilir ve keratin montajını inhibe edebilir; Epinodosin ve wangzaozin A sırasıyla HL-60 ve HeLa hücrelerinde hücre iskeletinin dinamik montajını etkileyebilir, sitoplazmik hücre iskeletinin yeniden düzenlenmesine neden olabilir, mikrofilamentlerin, mikrotübüllerin ve ara lif iskelet liflerinin dağılımını değiştirebilir ve sitoplazmik hücre iskeleti sisteminin homeostazına müdahale edebilir. Bununla birlikte, etki mekanizmaları iyi anlaşılmamıştır.

Bu makalede, ilk olarak düşük konsantrasyonlarda lökamenin E (0.4-1.0 μ mol/L) ile indüklenen HeLa hücre hücre iskeletinin yeniden düzenlenmesinin özelliklerini araştırdık. Düşük lökamenin E konsantrasyonu, uzun süreli tedaviden sonra (48 saat ve 72 saat) hücrelerin morfolojisini önemli ölçüde değiştirerek uzun şeritlerin oluşmasına, psödopodia sayısında önemli bir azalmaya, psödopodia uzamasına ve "böbrek şekilli çekirdeklerin" sayısında artışla birlikte nükleer morfolojide önemli bir değişikliğe neden olmuştur. Bilindiği gibi mikrofilamentler, mikrotübüller ve orta liflerin tümü hücrelerin ve çekirdeklerinin morfolojisini koruma işlevine sahiptir. Dolayısıyla bu değişiklikler, lökomenen E'nin hücre iskeletinin dinamik dengesine müdahale edebileceğini ve hücre iskeletinin yeniden düzenlenmesine neden olabileceğini düşündürmektedir. Daha fazla floresan boyama bu spekülasyonu doğrulamıştır: sitoplazmik stres liflerinin sayısı azalmış, mikrotübüller ve keratin lifleri çekirdek etrafında toplanmış, mikrotübül ve keratin ara liflerinin düzeni önemli ölçüde değişmiş ve bazı mikrotübül ve keratin ara lifleri kalınlaşmıştır. Akış sitometrisi analizi ayrıca HeLa hücrelerinde kohezif mikrofilamentlerde azalma, toplanmış mikrotübüllerde önemli bir artış ve keratin lif polimerizasyonunda hafif bir artış olduğunu doğrulamıştır. Bu sonuç, enantiyomerik diterpenoid wangzaozin A tarafından HeLa hücrelerinde hücre iskeletinin yeniden düzenlenmesinin indüklenmesine ilişkin önceki raporumuzla benzerdir. Bununla birlikte, HepG2, H1299, PLC ve HUVEC hücrelerinin 24 saat boyunca yüksek konsantrasyonlarda (2.0 ~ 4.0 μ mol / L) lökamenin E ile muamele edilmesi, hücre morfolojisinde minimum değişikliklerle sonuçlanmıştır, bu da düşük konsantrasyonlu muameleden sonra gözlenen değişiklik modelinden tamamen farklıdır. Yüksek konsantrasyonlarda lökomenen E'nin hücrelerde ERK sinyal yolunu aktive edebildiğini, K8-S431/73 ve K18-S52 fosforilasyonunu indükleyebildiğini, keratin lifi birleşmesini engellediğini ve keratin lifi sayısını azalttığını bulduk. Bu, farklı konsantrasyonlardaki lökomenen E'nin hücrelerde farklı sinyal yollarının düzenlenmesine katılarak farklı hücresel tepki olaylarına neden olabileceğini göstermektedir.

Hücre iskeletinin hücre bölünmesi ve göçüne derin katılımı, hücresel karsinogenez ve bozulma ile yakından ilişkilidir. Hücre iskeleti ve düzenleyici proteinlerden oluşan dinamik lif ağı, hücre morfolojisinde sürekli değişiklikler, hücre iskeletinin yeniden düzenlenmesi ve yönlü hücre hareketinin yönlendirilmesi şeklinde kendini gösteren hücre göçü sürecinde yer alır. Sitokalazin, kolşisin ve vinkristin gibi hücre iskeletini hedef alan bileşikler, hücre iskeletinin birleşmesini etkileyerek hücre çoğalmasını ve göçünü engeller. Araştırmamız, 0.8~1.0 μ mol/L lökomenen E'nin HeLa hücre hücre iskeletinin dinamik dengesine müdahale ederek sitoplazmik hücre iskeletinin önemli ölçüde yeniden düzenlenmesine neden olduğunu, hücre göçünü engellediğini ve hücre döngüsü çalışmasını engelleyerek hücre çoğalma oranını azalttığını göstermektedir. Bu durum, lökomenen E'nin yeni anti-kanser ilaçlarının araştırılması ve keşfedilmesinde önemli bir değere sahip olduğunu göstermektedir.

ROS, canlı organizmalarda üretilen ve O2, H2O2, - OH, vb. gibi moleküler oksijen kimyasından daha aktif olan oksijen içeren bir serbest radikal türüdür. Normal fizyolojik koşullar altında ROS, hücre kaderini belirlemede ve çeşitli sinyal moleküllerini değiştirmede ikinci bir haberci olarak önemli bir rol oynar. Araştırmalar, ROS'un hücre iskeletinin yeniden şekillenmesinin sinyal yoluna katıldığını, hücre iskeletini veya hücre iskeleti ile ilgili proteinleri doğrudan değiştirdiğini ve hücre iskeletinin yapısı ve işlevinde yer alan önemli bir düzenleyici faktör olduğunu doğrulamıştır. Daha önce, lökomenen E'nin hücre içi ROS seviyelerini artırabildiğini ve HL-60 hücrelerinde NADPH oksidaz aktivitesini düzenleyerek HL-60 hücrelerini olgun granülositlere farklılaşmaya teşvik ettiğini bildirmiştik. Bu çalışmada, HeLa hücrelerinin 0.4~1.0 μ mol/L lökomenen E ile muamelesi hücre içi ROS seviyelerini önemli ölçüde artırmış ve ROS içeriği artan ilaç konsantrasyonu ve uzayan tedavi süresi ile önemli ölçüde artmıştır. ROS'un, lökomenen E ile indüklenen hücre morfolojik değişikliklerinin, hücre göçü inhibisyonunun ve hücre iskeletinin yeniden düzenlenmesinin bir yukarı akış olayı olabileceğini tahmin ediyoruz. Lökmenen E, ROS sinyal yolu aracılığıyla hücre iskeletinin yeniden düzenlenmesini düzenleyerek hücre morfolojisinde değişikliklere ve hücre göçünün engellenmesine yol açabilir. Daha ileri deneyler yukarıdaki spekülasyonu doğrulamıştır: NAC ilavesinin lökomenen E tarafından indüklenen morfolojik değişiklikler üzerinde önemli bir inhibitör etkisi vardır (uzamış ve azalmış psödopodiye doğru) ve NAC'nin lökomenen E tarafından stres lifi azalmasının indüksiyonunu zayıflattığı ve mikrotübüllerin ve keratin liflerinin çekirdek etrafında toplanmasını azalttığı gözlenmiştir. Bu olgular, hücre iskeletinin yeniden düzenlenmesinin ve lökomenen E'nin neden olduğu hücre morfolojisindeki değişikliklerin ROS seviyelerindeki artışla ilişkili olduğunu göstermektedir. Çalışmalar, ROS'un mikrofilament agregasyonu ve depolimerizasyonunun dinamik süreçlerinde yer aldığını göstermiştir. İnsan ilkel kondrositlerinde, ROS'daki bir artış Racl'ın oksidatif modifikasyonunu teşvik eder ve aktin hücrelerinin hücre iskeleti yapısında değişikliklere neden olur; ROS, ERK yolu aracılığıyla testis Sertoli hücrelerinin (SC) stres lifi ağını ve diğer mikrofilament demetlerini bozar. Buna ek olarak, ROS mikrotübüllerin dinamik kararsızlığını önemli ölçüde etkiler, mikrotübül protein hücre iskeleti organizasyonunu düzenler ve mikrotübül protein modifikasyonunu indükler. ROS ve keratin lif polimerizasyonu arasındaki korelasyon ve mekanizma hakkında ilgili bir rapor bulunmamaktadır. Lökamenin E'nin neden olduğu hücre iskeletinin yeniden düzenlenmesinin, ROS seviyelerinin artması yoluyla hücre iskeletinin yeniden düzenlenmesi ile ilgili sinyal yollarının aktivasyonu ile tetiklendiğini tahmin ediyoruz, ancak spesifik yolu doğrulamak için daha fazla araştırmaya ihtiyaç vardır. Lai ve arkadaşları naringinin HeLa hücrelerinde ROS seviyelerinde bir artışa neden olduğunu, ROS/JNK/Bcl2 yolunu aktive ettiğini ve hücre çoğalmasını ve göçünü engellediğini bildirmiştir. Araştırmamız, ROS'un hücre iskeleti sistemi üzerinde sinyal molekülleri olarak hareket edebileceğini, hücre hareketi sırasında hücre iskeletinin koordineli olarak yeniden düzenlenmesine müdahale ederek hücre göçünün engellenmesine yol açabileceğini doğrulamaktadır. Lökamenin E'nin hücre çoğalmasını inhibe ettiği sinyal yolu üzerinde daha derinlemesine araştırmalara ihtiyaç vardır.