A Leukamenin E által kiváltott citoplazmatikus citoszkeleton átrendeződés és a migráció gátlása humán méhnyakrákos HeLa sejtekben
Az eukarióta sejtekben a mikrofilamentumok, mikrotubulusok és köztes rostok kötőfehérjéikkel összekapcsolódva egy rendkívül rendezett, háromdimenziós hálózatszerű citoplazmatikus vázrendszert alkotnak. Részt vesznek a sejtek kulcsfontosságú életfolyamataiban, például az anyagszállításban, az információátvitelben, a sejtosztódásban, a sejtvándorlásban és a sejtmorfológia fenntartásában. A citoszkeleton dinamikus folyamata erősen szabályozott, hogy a sejtek élettevékenységeinek igényeit szolgálja, és összeszerelési zavara a sejtnövekedés gátlásához, a sejtosztódás leállásához, sőt a sejt apoptózisához is vezethet. Egyes daganatellenes gyógyszerek a citoszkeleton depolimerizációjának és polimerizációjának megváltoztatásával megzavarhatják a mikrotubulusok dinamikus egyensúlyát, ezáltal gátolhatják a sejtproliferációt és daganatellenes hatást fejthetnek ki. A növényi eredetű rákellenes gyógyszerek, a katarantusz alkaloidák és a taxánok képesek a β - tubulinhoz kapcsolódni, beavatkozni a mikrotubulus-váz dinamikus folyamatába, és különböző daganatok, többek között emlőrák, tüdőrák, neuroblastóma, rabdomioszarkóma, akut leukémia stb. kezelésére használhatók. A citoszkeleton és a hozzá kapcsolódó fehérjéket célzó daganatellenes gyógyszerek kutatása és felfedezése nagyon aktív határterületi kutatási területté vált.

A reaktív oxigénfajok (ROS) jelzőmolekulaként működnek a sejteken belül, és részt vesznek az olyan fontos sejtszintű életfolyamatokban, mint a sejtproliferáció és a differenciálódás. A tumorsejtek anyagcsere-útvonalaiban bekövetkező változások miatt megnő a ROS, különösen a H2O2 tartalma, ami a tumorsejteket érzékenyebbé teszi a ROS-szintek változásaira. Ezért az intracelluláris komponensek ROS-termeléssel és antioxidáns védelemmel történő specifikus módosításait a rákkezelés célpontjaiként azonosították. A kutatások kimutatták, hogy a NADPH-oxidáz és más források által generált ROS közvetlenül módosíthatja a mikrofilamentumokat, mikrotubulusokat és köztes selyemfehérjéket, befolyásolva azok dinamikus összeszerelési-lebontási folyamatait, vagy a citoszkeleton átformálását a Rho GTPáz upstream aktiválásával a kapcsolódó jelátviteli utakon keresztül. A NADPH-oxidáz által közvetített intracelluláris oxidatív stressz szintén fontos szabályozó szerepet játszik a citoszkeletettel kapcsolatos betegségekben. Az utóbbi években a kutatók széles körű érdeklődést mutattak a ROS-ok részvétele iránt a citoszkeleton dinamikájának szabályozásában.

A Camellia nemzetségben több mint 90 növényfaj található Kínában, amelyek közül körülbelül 30-at használnak gyógyászati célokra. Közülük az Isodon rubescens egykor a Kínai Gyógyszerkönyvben is szerepelt, és elsősorban antibakteriális, gyulladáscsökkentő és daganatellenes betegségek kezelésére használják. Az oridonin, mint a Lonicera japonica fő hatóanyaga, kiterjedten tanulmányozták daganatellenes mechanizmusát, és szerkezeti módosításai I. fázisú klinikai vizsgálatokba kerültek, mint leukémia elleni gyógyszerek. Több mint 1300 enantiomer kaempferol-diterpén fajt fedeztek fel, amelyek különösen a Camellia nemzetségbe tartozó növények ágaiban és leveleiben fordulnak elő. Ezek a vegyületek kiterjedt rákellenes aktivitást mutatnak, és várhatóan új daganatellenes gyógyszerek felfedezéséhez vezetnek. Jelenleg csak nagyon kevés enantiomer diterpént, például az arbutint vizsgálták széleskörűen és szisztematikusan rákellenes mechanizmusaik szempontjából. A többi ilyen típusú diterpénnel kapcsolatos kutatások még mindig hiányoznak, de az elmúlt években jelentős előrelépés történt. Az elmúlt években megállapították, hogy a kaempferol-diterpének bizonyos enantiomerjei képesek a citoszkeleton rendszerre hatni és rákellenes hatást kifejteni. Például a bacteriocin A közvetlenül a BubR1 fehérjét célozza meg, hogy aktiválja az orsó-összeszerelési ellenőrzési pontot, megakadályozza a középső és késői sejtátmenetet, és gátolja a Raji és Jurkat leukémiasejtek mitotikus fázisát; a Wangzaozin A és az epinodozin a citoszkeleton (mikrofilamentumok, mikrotubulusok és intermedier filamentumok) átrendeződését indukálja HeLa és HL-60 sejtekben, ami a sejtdifferenciálódás indukciójával jár együtt; a Leukamenin E szintén képes keratin foszforilációt indukálni HUVEC és PLC sejtekben, ezáltal gátolja a keratin rosthálózat normális összeállását. Ez a cikk továbbra is beszámol a leukamenin E hatásairól a három vázrost (mikrofilamentumok, mikrotubulusok és keratinrostok) átrendeződésére HeLa sejtekben, valamint a sejtnövekedés és a migráció gátlásának lehetséges mechanizmusairól. Ez támpontokat nyújt az enantiomer kaempferol-diterpenoidok rákellenes molekuláris mechanizmusainak tisztázásához, valamint tudományos alapot nyújt e vegyület további fejlesztéséhez és alkalmazásához.

Az elmúlt években az enantiomer kaempferol-diterpének rákellenes farmakológiai aktivitása széles körű érdeklődést váltott ki a kutatók körében. Egyre több jelentés született e különböző molekuláris konfigurációjú vegyületek rákellenes mechanizmusairól, és kiderült, hogy a sejtek életfolyamataira gyakorolt hatásuk sokrétű, molekuláris szinten több célpontot érintő hatásokat mutat. Például a sejtek apoptózisának és differenciálódásának indukálása különböző sejtes jelátviteli útvonalakon keresztül; A peroxidázok I és II, a BubR1 fehérje és az AML1-ETO rákos fehérje célpontja, szabályozhatja a NADPH-oxidáz aktivitást és indukálhatja a keratin foszforilációt. Kutatócsoportunk egymás után számolt be az enantiomer kaempferol-diterpének citoszkeleton rendszerre gyakorolt hatásairól: A leukamenin E a sejtkeratin K8 és K18 foszforilációját indukálhatja és gátolhatja a keratin összeszerelődését; az epinodozin és a wangzaozin A a HL-60 és HeLa sejtek citoszkeleton dinamikus összeszerelődését befolyásolhatja, citoplazmatikus citoszkeleton átrendeződést okozva, megváltoztatva a mikrofilamentumok, mikrotubulusok és köztes rostváz rostok eloszlását, és beavatkozva a citoplazmatikus citoszkeleton rendszer homeosztázisába. Hatásmechanizmusuk azonban nem jól ismert.

Ebben a cikkben először a HeLa sejtek citoszkeleton átrendeződésének jellemzőit vizsgáltuk, amelyet a leukamenin E alacsony koncentrációja (0,4-1,0 μ mol/l) indukál. A leukamenin E alacsony koncentrációja jelentősen megváltoztatta a sejtek morfológiáját hosszabb kezelés után (48 és 72 óra), ami hosszú csíkok kialakulását, az álpodiumok számának jelentős csökkenését, az álpodiumok megnyúlását és a sejtmag morfológiájának jelentős változását eredményezte, a "vese alakú sejtmagok" számának növekedésével. Mint ismeretes, a mikrofilamentumok, a mikrotubulusok és a médiumrostok mind a sejtek és a sejtmagok morfológiájának fenntartását szolgálják. Ezért ezek a változások arra utalnak, hogy a leukomén E beavatkozhat a citoszkeleton dinamikus egyensúlyába, és a citoszkeleton átrendeződését idézheti elő. További fluoreszcens festés megerősítette ezt a feltételezést: a citoplazmatikus stresszrostok száma csökkent, a mikrotubulusok és keratinrostok a sejtmag köré gyűltek, a mikrotubulus- és keratin intermedier rostok elrendeződése jelentősen megváltozott, és néhány mikrotubulus- és keratin intermedier rost megvastagodott. Az áramlási citometriás elemzés szintén megerősítette a kohéziós mikrofilamentumok csökkenését, az aggregált mikrotubulusok jelentős növekedését és a keratinrostok polimerizációjának enyhe növekedését a HeLa sejtekben. Ez az eredmény hasonló a citoszkeleton átrendeződésének HeLa sejtekben az enantiomer diterpenoid wangzaozin A által történő indukciójáról szóló korábbi jelentésünkhöz. A HepG2, H1299, PLC és HUVEC sejtek magas koncentrációjú (2,0~4,0 μ mol/L) leukamenin E-vel történő 24 órás kezelése azonban minimális változásokat eredményezett a sejtmorfológiában, ami teljesen különbözik az alacsony koncentrációjú kezelés után megfigyelt változások mintázatától. Megállapítottuk, hogy a leukamenin E magas koncentrációi képesek aktiválni az ERK jelátviteli útvonalat a sejtekben, a K8-S431/73 és a K18-S52 foszforilációját indukálják, gátolják a keratinrostok összeszerelődését és csökkentik a keratinrostok számát. Ez azt jelzi, hogy a leukomén E különböző koncentrációi részt vehetnek a sejtekben különböző jelátviteli utak szabályozásában, különböző sejtválasz-előfordulásokat okozva.

A citoszkeleton mélyreható részvétele a sejtosztódásban és a vándorlásban szorosan összefügg a sejtek karcinogenezisével és romlásával. A citoszkeletonból és szabályozó fehérjékből álló dinamikus rosthálózat részt vesz a sejtvándorlás folyamatában, ami a sejtmorfológia folyamatos változásában, a citoszkeleton újrarendeződésében és a sejtek irányított mozgásának irányításában nyilvánul meg. A citoszkeletonra ható vegyületek, mint például a citokalazin, a kolhicin és a vinkrisztin, a citoszkeleton összeszerelésének befolyásolásával gátolják a sejtek proliferációját és migrációját. Kutatásaink azt mutatják, hogy a 0,8~1,0 μ mol/L leukomén E képes beavatkozni a HeLa sejtek citoszkeletonjának dinamikus egyensúlyába, ami a citoplazma citoszkeleton jelentős átrendeződését okozza, gátolja a sejtmigrációt, és a sejtciklus működésének blokkolásával csökkenti a sejtproliferációs rátát. Ez azt jelzi, hogy a leukomén E fontos értékkel bír az új rákellenes gyógyszerek kutatásában és felfedezésében.

A ROS az élő szervezetekben keletkező oxigéntartalmú szabad gyökök olyan típusa, amely aktívabb, mint a molekuláris oxigén kémiai vegyületek, mint például az O2, H2O2, - OH stb. Normál fiziológiai körülmények között a ROS fontos szerepet játszik második hírvivőként a sejtsors meghatározásában és a különböző jelzőmolekulák módosításában. A kutatások megerősítették, hogy a ROS részt vesz a citoszkeleton átalakításának jelátviteli útvonalában, közvetlenül módosítja a citoszkeleton vagy a citoszkeletonhoz kapcsolódó fehérjéket, és fontos szabályozó tényező, amely részt vesz a citoszkeleton szerkezetében és működésében. Korábban arról számoltunk be, hogy a leukomén E képes növelni az intracelluláris ROS-szintet, és a HL-60 sejtek NADPH-oxidáz aktivitásának szabályozásával a HL-60 sejtekben érett granulocitákká történő differenciálódást indukálni. Ebben a vizsgálatban a HeLa sejtek 0,4~1,0 μ mol/L leukomén E-vel történő kezelése jelentősen megnövelte az intracelluláris ROS-szintet, és a ROS-tartalom jelentősen nőtt a hatóanyag-koncentráció növelésével és a kezelési idő meghosszabbításával. Feltételezzük, hogy a ROS a leukomenen E által kiváltott sejtmorfológiai változások, a sejtmigráció gátlása és a citoszkeleton átrendeződésének upstream eseménye lehet. A leukmenen E a ROS jelátviteli útvonalon keresztül szabályozhatja a citoszkeleton átrendeződését, ami a sejtmorfológia megváltozásához és a sejtmigráció gátlásához vezet. További kísérletek megerősítették a fenti feltételezést: a NAC hozzáadása jelentős gátló hatással van a leukomén E által indukált morfológiai változásokra (a megnyúlt és csökkentett hosszúkás pszeudopódiumok irányába), és megfigyelhető volt, hogy a NAC gyengítette a leukomén E által indukált stresszrost-redukciót, és csökkentette a mikrotubulusok és keratinrostok aggregációját a sejtmag körül. Ezek a jelenségek arra utalnak, hogy a citoszkeleton átrendeződése és a sejtmorfológia leukomenen E által okozott változásai a ROS-szintek emelkedésével járnak együtt. Vizsgálatok kimutatták, hogy a ROS részt vesz a mikrofilamentumok aggregációjának és depolimerizációjának dinamikus folyamataiban. Humán primitív kondrocitákban a ROS növekedése elősegíti a Racl oxidatív módosítását és változásokat indukál az aktin sejtek citoszkeleton szerkezetében; a ROS az ERK útvonalon keresztül megbontja a herék Sertoli sejtjeinek (SC) stressz rost hálózatát és más mikrofilamentum kötegeit. Ezenkívül a ROS jelentősen befolyásolja a mikrotubulusok dinamikus instabilitását, szabályozza a mikrotubulus fehérje citoszkeleton szerveződését, és indukálja a mikrotubulus fehérje módosítását. A ROS és a keratinszálak polimerizációja közötti összefüggésről és mechanizmusról nincsenek releváns jelentések. Feltételezésünk szerint a citoszkeleton leukamenin E által okozott átrendeződését a citoszkeleton átrendeződésével kapcsolatos jelátviteli útvonalak aktiválása váltja ki a ROS-szintek emelkedésén keresztül, de további kutatások szükségesek a konkrét útvonal megerősítéséhez. Lai és munkatársai arról számoltak be, hogy a naringin a HeLa sejtekben a ROS-szintek növekedését idézte elő, aktiválta a ROS/JNK/Bcl2 útvonalat, és gátolta a sejtproliferációt és a migrációt. Kutatásunk megerősíti, hogy a ROS jelzőmolekulaként hathat a citoszkeleton rendszerre, zavarva a sejtmozgás során a citoszkeleton koordinált átrendeződését, ami a sejtmigráció gátlásához vezet. További mélyreható kutatásokra van szükség annak a jelátviteli útvonalnak a feltárására, amelyen keresztül a leukamenin E gátolja a sejtproliferációt.