Flavonoid bileşenlere dayalı olarak farklı incir çeşitlerinin hasat zamanlaması ve antikanser aktivitesi üzerine çalışma
Ficus carica L., Moraceae familyasındaki Ficus cinsine ait ılıman yaprak döken bir meyve ağacıdır. Fırat ve Dicle Nehri havzalarına özgüdür ve 10000 yılı aşkın bir ekim geçmişi ile insanlar tarafından evcilleştirilen en eski kültür meyve ağaçlarından biridir. Flavonoidlerin antibakteriyel ve anti-tümör etkileri ile potansiyel bir doğal antioksidan olduğu kanıtlanmıştır. İncirin kökleri, sapları, yaprakları ve meyveleri ilaç olarak kullanılabilir. 1950'lerde Ullman, hayvan bağırsaklarının harici incir sütü ile tedavi edilmesinin, ciddi vakalarda hayvan ölümüne yol açabilecek önemli kılcal damar hasarına neden olabileceğini öne sürmüştür; Ancak ağızdan alınırsa toksisite yoktur. İncir sütünden dört aktif bileşen izole edilmiş, bunlardan iki bileşen farelerde nakledilen sarkomun büyümesini engellemek için deri altından veya damar içinden enjekte edilmiştir. Daha sonra incir emülsiyonunun farelerde primer meme kanseri hücrelerinin büyümesini önemli ölçüde inhibe edebildiği, kanser hücrelerinin nekrozuna neden olduğu, nakledilen adenokarsinom, miyeloid lösemi, lenfosarkom ve sarkom oluşumunu geciktirdiği ve sarkom dejenerasyonuna neden olduğu doğrulanmıştır. Çin'de Wang ve arkadaşları ilk olarak incir kökleri, sapları, yaprakları ve meyvelerinden (genç ve olgun meyveler dahil) elde edilen özütlerin S180 sarkomu, akciğer kanseri, karaciğer kanseri ve Ehrlich ascites karsinomuna karşı önemli inhibitör aktivite sergilediğini bildirmiştir. Tümör taşıyan farelere veya kanser hastalarına, deneysel deneklerin bağışıklık fonksiyonunu iyileştirebilecek incir suyu özütü sağladılar. Bu nedenle, incir preparatlarının kemoterapi ve radyoterapi hastalarının ağrılarını hafifletmek ve yaşam kalitelerini artırmak için doğal ve toksik olmayan bir adjuvan ilaç olarak kullanılabileceği önerilmektedir. Bununla birlikte, incirin etkili anti-kanser bileşenleri henüz aydınlatılmamıştır. Takeuchi ve arkadaşları ilk olarak benzaldehitin incirin ana anti-kanser bileşeni olduğunu öne sürmüşlerdir. Yin ve arkadaşları incirin anti-kanser etkisinin kumarin bileşikleri, benzaldehit ve furan halkalı küçük moleküllü aromatik bileşiklerin birleşik etkisinin sonucu olduğuna ve benzaldehitin güçlendiricilerden veya organik aktif moleküllerden sadece biri olduğuna inanmaktadır. Daha sonra incir polisakkaritlerinin anti-kanser aktivitesine sahip olduğu keşfedilmiştir. Bununla birlikte, polisakkaritlerin yapısı karmaşıktır ve anti-tümör ile ilişkilerinin daha fazla araştırılması gerekmektedir. Öte yandan, flavonoidler ve anti-kanser arasındaki ilişki dikkat çekmiştir. Sharada ve arkadaşları, incirde bulunan flavonoid bir madde olan morinin, sıçanlarda 1,2-dimetilhidrazin (DMH) ile indüklenen kolon kanseri gelişimini engelleyebileceğini öne sürmüştür. Bu araştırmayla ilgili takip raporları eksiktir. İncirin çok sayıda çeşidi olması nedeniyle, farklı aşamalarda olgunlaşan meyvelerin yaprakları farklı işlevlere sahip olabilir. Bu nedenle, bu çalışmada Temmuz-Kasım 2019 tarihleri arasında üç incir çeşidinin yaprakları toplanmış, flavonoidler ekstrakte edilmiş ve rafine edilmiş ve incir flavonoidlerinin farklı aylarda insan kanser hücresi proliferasyonu üzerindeki inhibitör aktivitesi incelenmiştir. İncir flavonoidlerinin anti-kanser mekanizması araştırılmış ve anti-kanser tıbbında incir flavonoidlerinin uygulanması ve geliştirilmesi için teorik temel sağlamak amacıyla flavonoid maddeler ile anti-kanser aktivitesi arasındaki ilişki analiz edilmiştir.

Flavonoidler, üç karbon atomu ile bağlanmış iki benzen halkasından oluşan bir dizi bileşiktir. C6-C3-C6 yapısına sahiptirler, suda çözünmezler veya çözünmezler ve metanol, etanol ve etil asetat gibi organik çözücülerde kolayca çözünürler. Bu nedenle, incir alkol ekstresi ve hatta incir şarabı belirli miktarda flavonoid içerir ve anti-kanser aktivitesine sahiptir. Anti-tümör etkileri açısından, Bai ve arkadaşları, S180 solid tümör taşıyan farelere intraperitoneal olarak enjekte etmek için incir etanol özütü kullanmış ve sarkom büyümesi üzerinde önemli bir inhibitör etkiye sahip olduğunu, organ indeksini artırdığını ve T lenfosit yüzdesini artırdığını bulmuşlardır; bu da incir etanol özütünün tümör taşıyan farelerin bağışıklık fonksiyonunu artırarak anti-tümör etkilere sahip olabileceğini düşündürmektedir. Bu, incir flavonoidlerinin hayvan tümörlerini inhibe ettiğine dair ilk rapordur. Bu deneyde, incir yapraklarından elde edilen flavonoidlerin insan mide kanseri hücreleri SGC-7901'in proliferasyonu üzerinde önemli inhibitör aktiviteye sahip olduğunu, ancak mide kanseri BGC-823 ve karaciğer kanseri Hepg-2 hücrelerinin proliferasyonu üzerinde nispeten düşük etkilere sahip olduğunu gözlemledik (bkz. Şekil 1). Farklı aylarda farklı çeşitlerden toplanan yapraklardan elde edilen anti-kanser etkilerinden, flavonoidlerin SGC-7901 hücreleri üzerindeki inhibisyon oranının Ağustos ayında 'Braunschweig' yapraklarında en yüksek olduğu, diğer çeşitlerin ve ayların yapraklarındaki flavonoidlerin inhibisyon oranlarının ise nispeten düşük olduğu görülebilir (bkz. Tablo 2). Sadece belirli çeşit ve aylardaki incir yapraklarından elde edilen flavonoidlerin belirli tümör hücrelerinin çoğalması üzerinde önemli bir etkiye sahip olduğu görülmektedir. Bazı kişiler ağustosböceği cordyceps'in etanol özütünün SGC-7901'de kanser hücresi çoğalması üzerinde en yüksek inhibisyon oranına sahip olduğunu öne sürmüştür. Bu deneyin sonuçları da buna benzerdir. İncir yapraklarındaki flavonoid konsantrasyonu arttıkça, mide kanseri SGC-7901 hücrelerinin sayısı azalmış, kısalmış ve buruşmuş, hücre plakasından kademeli olarak ayrılmış ve inhibitör etkisi doz etkisi göstermiştir (bkz. Şekil 2). Bu, incir yapraklarının hasat zamanlamasının belirlenmesi ve flavonoidlerin anti-kanser etkilerinin geliştirilmesi için teorik bir temel sağlar.
İncir yapraklarında flavonoidler tarafından hücre apoptozunun indüklenmesini gözlemlemek için ilk kez akış sitometrisi kullandık (bkz. Şekil 3). Flavonoid konsantrasyonu 200 μg/mL olduğunda, hücrelerin toplam apoptoz oranı 39.08% idi; konsantrasyon 1600 μg/mL'ye ulaştığında, toplam apoptoz oranı 83.60%'ye ulaştı. Buna dayanarak, incir flavonoidlerinin SGC-7901 hücreleri üzerindeki yarı öldürücü konsantrasyonu 577 25 μ g/mL olarak hesaplanmıştır. Bu, Purnamasari ve arkadaşları tarafından incir metanol ekstraktında Huh7it karaciğer kanseri hücreleri için önerilen 653 μg/mL yarı inhibitör konsantrasyona benzerdir. İncir yapraklarından elde edilen metanol özütünün karaciğer kanseri hücrelerinin çoğalmasını engelleyebileceğini, apoptozu teşvik edebileceğini ve hücre nekrozuna yol açabileceğini bulmuşlardır. Apoptoz, esas olarak endojen mitokondriyal yollar ve eksojen ölüm reseptörü düzenleyici yollar dahil olmak üzere bir dizi genin aktivasyonunu, ekspresyonunu ve düzenlenmesini içerir. Mitokondriyal membran potansiyelindeki düşüş, erken mitokondriyal bağımlı apoptozun ayırt edici bir olayıdır. Garcí a-Zepeda ve arkadaşları, resveratrolün servikal kanser hücre hatlarında mitokondriyal membran potansiyelinde bir düşüşe neden olduğunu ve kanser hücresi apoptozunu desteklediğini göstermiştir. Bu deneyde incir flavonoidlerinin insan mide kanseri SGC-7901 hücrelerinin mitokondriyal membran potansiyeli seviyesini düşürdüğü gözlemlenmiştir (bkz. Şekil 4). Bu, incir yapraklarındaki flavonoidlerin SGC-7901 hücrelerinde mitokondriyal membran potansiyeli seviyelerinde bir düşüşe neden olarak apoptozu teşvik ettiğini göstermektedir.
İncir yapraklarındaki flavonoidlerin kanser hücrelerinin hücre döngüsü üzerindeki inhibitör etkisini de gözlemledik ve esas olarak S fazındaki SGC-7901 hücrelerinin mitozunu bloke ettiklerini, bazılarının da G2 fazında olduğunu gördük (bkz. Şekil 5). Kapsaisinin S fazındaki endometriyal kanser hücrelerini bloke edebildiği ve apoptoz oranında artışa neden olduğu bildirilmiştir. Araştırmalara göre kapsaisinin antikanser mekanizması, hücre döngüsüne bağlı protein kinazlar CDK2, CDK4 ve CDK6 proteinlerinin ekspresyonunu inhibe etmektir. Yapay olarak sentezlenen flavonoid amino asit türevleri de MGC-803 mide kanseri hücre döngüsünün G2/M fazını inhibe ederken, anti apoptotik protein Bcl-2 ekspresyonunu aşağı ve pro apoptotik protein Bax ekspresyonunu yukarı düzenleyerek hücre apoptozunu tetikleyebilir. Bu deneyde incir flavonoidlerinin SGC-7901 hücrelerinde apoptozu inhibe etme mekanizması mRNA düzeyinde analiz edilmiştir. İncir yaprağı flavonoidleri ile tedavi edilen SGC-7901 hücrelerinde CDK1, CDK2, CDK6 ve CyclinD1 genlerinin ifadesinin önemli ölçüde azaldığını, E2F1 ifadesinin ise arttığını tespit ettik (bkz. Şekil 6B). Çeşitli tümör dokularında, CDK'lar anormal şekilde aktive olmuş durumdadır ve CDK ekspresyonunun inhibe edilmesi kontrolsüz tümör proliferasyonunu baskılayabilir. Buna ek olarak, incir yapraklarındaki flavonoidlerle muamele, tümör baskılayıcı genler P53 ve Bax'ın yanı sıra onkogen Bcl-2'nin ifadesini de etkilemiştir (bkz. Şekil 6A). Bu üç gen arasında Bax ve Bcl-2 aynı gen ailesine aittir. Bunlar arasında Bcl-2 hücre döngüsünü teşvik ederken, Bax ve Bcl-2 ikincisinin aktivitesini antagonize eden, hücre döngüsünü inhibe eden ve hücre apoptozuna neden olan bir protein dimeri oluşturur. Raporlara göre, Tianshan Snow Lotus'tan elde edilen flavonoidler, insan özofagus kanseri hücrelerinde CaEs-17Bax ekspresyonunu yukarı ve Bcl-2 ekspresyonunu aşağı doğru düzenleyerek hücre apoptozunu indükleyebilir. İncir yapraklarında gözlemlenen flavonoidler tümör baskılayıcı genler P53 ve Bax'ın ekspresyonunu teşvik ederken, tümör baskılayıcı gen Bcl-2'nin ekspresyonunu inhibe eder. Bu durum, incir yaprağı flavonoidlerinin mide kanseri hücre hattı SGC-7901 üzerindeki apoptozu indükleyici etkisinin, apoptozla ilgili genler Bax, P53 ve Bcl-2'nin ekspresyonunu düzenleyerek elde edilebileceğini göstermektedir.
İncir yaprağı flavonoidlerinin mide kanseri SGC-7901 hücrelerinin çoğalmasını inhibe etmedeki spesifik aktif bileşenlerini araştırmak için, incir yaprağı flavonoidlerinin farklı çeşit ve aylarda insan mide kanseri SGC-7901 hücre çoğalması üzerindeki farklı inhibitör etkilerine dayalı olarak LCMS/MS kalitatif ve kantitatif analiz için üç örnek ( Ağustos ayında 'Branrick', Eylül ayında 'Masyutaofen' ve Eylül ayında 'Bojihong') seçtik. Tarama sonrasında, kanser inhibisyon oranı ile yüksek oranda korelasyon gösteren 12 diferansiyel metabolit elde edilmiştir (bkz. Tablo 3). Bunlar arasında, narkissin ve incir flavonoidlerinin anti-kanser oranı arasında oldukça önemli bir pozitif korelasyon vardır. Narkissosidin antiviral aktiviteye sahip olduğu ve ayrıca Alzheimer hastalığı, tip II diyabet, Parkinson hastalığı gibi protein konformasyon hastalıklarının önlenmesi ve tedavisinde büyük öneme sahip olduğu bildirilmiştir. Son zamanlarda, narkissosidin COVID-19'u önlemek ve tedavi etmek için kullanılabileceği öne sürülmüştür. Bununla birlikte, anti-kanser etkilerinin olup olmadığı araştırılmaya devam etmektedir. Tablo 3'teki sonuçlar ayrıca isoquercetin ile incir flavonoidlerinin anti-kanser oranı arasında önemli bir korelasyon olduğunu göstermektedir. İzokuersetinin glioma dokusunda miR-23a ekspresyonunu önemli ölçüde inhibe edebildiği ve böylece kanser hücresi proliferasyonunu baskıladığı bildirilmiştir. Bu nedenle, incir yapraklarındaki isoquercetin ile anti-tümör aktivitesi arasındaki ilişki daha fazla araştırmayı hak etmektedir. Üçüncü olarak, melanin tümör hücrelerinin büyümesini engelleyebilir ve hücre döngüsünün S fazında meydana gelir. Ancak bazı kişiler blokajın G2/M fazında gerçekleştiğine de inanmaktadır. Bu çalışmada melaninin varlığı da tespit edilmiş ve içeriği ile anti-kanser oranı arasındaki korelasyon katsayısı r= 9923, P=0.08 olarak bulunmuştur. Her ne kadar 0.05 seviyesine ulaşmamış olsa da, çok yakındır. Ayrıca, incir yapraklarından elde edilen flavonoidlerin SGC-7901 hücrelerinin S fazındaki hücre döngüsü etkisini inhibe ettiğini gözlemledik. Bu önceki sonuçlarla benzerlik göstermektedir. İncirlerin Moraceae ailesindeki Ficus cinsine ait olması nedeniyle, bu flavonoid maddenin incirlerin antikanser aktivitesiyle ilişkili olup olmadığı daha fazla incelenmeye değerdir. Ayrıca, 6-dihidroksibenzoik asit, vanillofenon, siyanidin-3-O-rutinosid klorür, antosiyaninler, epikateşin, sinapin vb. içeriklerinin incir flavonoidlerinin antikanser oranı ile önemli ölçüde ilişkili olduğunu gözlemledik (bkz. Tablo 3). Kateşinlerin insan karaciğer kanseri üzerinde inhibitör etkileri olduğu bildirilmiştir. Ancak bu deneyde, incir yaprağı flavonoidlerinin karaciğer kanseri HepG-2 üzerindeki inhibitör etkisinin nispeten düşük olduğunu gözlemledik (bkz. Şekil 1), bu da SGC-7901 üzerindeki inhibitör etkisinin epikateşin ile ilişkili olmayabileceğini düşündürmektedir. Diğer metabolitler ve antikanser etkiler arasındaki ilişki şu anda nadiren rapor edilmektedir.
Özetle, bu makalede ilk olarak Temmuz'dan Kasım'a kadar 'Branrick', 'Masyutaofen' ve 'Bojihong' olmak üzere üç çeşidin yapraklarındaki flavonoidlerin farklı kanser hücre hatlarının çoğalması üzerindeki inhibitör etkinliği analiz edilmiştir. Ağustos ayında 'Branrick' incir çeşidinin SGC-7901 mide kanseri üzerinde en yüksek flavonoid inhibitör oranına sahip olduğu bulunmuştur. Flavonoid konsantrasyonu arttıkça, kanser hücrelerinin yoğunluğu ve yapışması azalmakta, canlı hücre sayısı azalmakta ve ölü hücrelerin ve geç apoptotik hücrelerin oranı artmaktadır. Kanser inhibisyon mekanizması üzerine yapılan araştırmalar, incir yapraklarından elde edilen flavonoidlerin hücre döngüsünü S fazında ve az miktarda da G2 fazında bloke ettiğini göstermiştir. Hücrelerin mitokondriyal membran potansiyeli önemli ölçüde azalır ve pro apoptotik genler Bax ve p53'ün yanı sıra hücre döngüsü düzenleyici gen E1F2'nin ekspresyon seviyeleri önemli ölçüde artar. Anti apoptotik gen Bcl-2'nin yanı sıra hücre döngüsü ile ilgili genler Cy-clinD1 ve CDK'ların ifade düzeyleri önemli ölçüde azalır. Bunlar incir yaprağı flavonoidlerinin kanser hücresi apoptozunu teşvik ettiği önemli mekanizmalardır. Buna ek olarak, LC-MS/MS teknolojisi ve ilgili analizlerin yardımıyla, narsisin, izorhamnosid ve dut pigmenti gibi kanser inhibisyon oranlarıyla yüksek oranda ilişkili birkaç farklı metabolit taradık. Bu, gelecekte incir yaprakları için anti-kanser ilaçlarının geliştirilmesi için yeni ufuklar açmaktadır.