Undersøgelse af høsttidspunkt og anticanceraktivitet i forskellige figensorter baseret på flavonoide komponenter
Ficus carica L. er et tempereret løvfældende frugttræ, der tilhører Ficus-slægten i Moraceae-familien. Det er hjemmehørende i Eufrats og Tigris' flodbækkener og er et af de tidligst dyrkede frugttræer, der blev domesticeret af mennesker, med en plantningshistorie på over 10.000 år. Flavonoider har vist sig at være en potentiel naturlig antioxidant med antibakterielle og antitumorale virkninger. Fignernes rødder, stængler, blade og frugter kan alle bruges som medicin. I 1950'erne foreslog Ullman, at behandling af dyretarme med ekstern figenmælk kan forårsage betydelig kapillærskade, hvilket kan føre til dyrets død i alvorlige tilfælde; men hvis det tages oralt, er der ingen toksicitet. Fire aktive komponenter blev isoleret fra figenmælk, hvoraf to komponenter blev injiceret subkutant eller intravenøst for at hæmme væksten af transplanteret sarkom hos mus. Det blev efterfølgende bekræftet, at figenemulsion kunne hæmme væksten af primære brystkræftceller i mus betydeligt, forårsage nekrose af kræftceller, forsinke forekomsten af transplanteret adenokarcinom, myeloid leukæmi, lymfosarkom og sarkom og forårsage degeneration af sarkom. I Kina rapporterede Wang et al. først, at ekstrakter fra figenrødder, stængler, blade og frugter (herunder unge og modne frugter) udviste signifikant hæmmende aktivitet mod S180-sarkom, lungekræft, leverkræft og Ehrlich-ascites-karcinom. De gav figenvandsekstrakt til tumorbærende mus eller kræftpatienter, hvilket kan forbedre forsøgspersonernes immunfunktion. Derfor foreslås det, at figenpræparater kan bruges som et naturligt og ikke-toksisk adjuverende lægemiddel til at lindre smerten hos kemoterapi- og strålebehandlingspatienter og forbedre deres livskvalitet. De effektive anti-cancer ingredienser i figner er dog ikke blevet belyst endnu. Takeuchi et al. foreslog først, at benzaldehyd er den vigtigste kræfthæmmende komponent i figner. Yin et al. mener, at fignernes kræfthæmmende virkning er resultatet af den kombinerede virkning af kumarinforbindelser, benzaldehyd og små aromatiske furanringforbindelser, hvor benzaldehyd kun er en af forstærkerne eller de organiske aktive molekyler. Senere opdagede man, at figenpolysaccharider har anti-cancer-aktivitet. Polysakkaridernes struktur er dog kompleks, og deres forhold til antitumor skal udforskes yderligere. På den anden side har forholdet mellem flavonoider og anti-cancer tiltrukket sig opmærksomhed. Sharada et al. foreslog, at morin, et flavonoidstof, der findes i figner, kan hæmme udviklingen af tyktarmskræft fremkaldt af 1,2-dimethylhydrazin (DMH) hos rotter. Der mangler opfølgende rapporter om denne forskning. På grund af de mange figensorter kan bladene fra frugter, der modnes på forskellige stadier, have forskellige funktioner. Derfor indsamlede denne undersøgelse blade af tre figensorter fra juli til november 2019, udtrak og raffinerede flavonoider og undersøgte den hæmmende aktivitet af figenflavonoider på spredning af humane kræftceller i forskellige måneder. Figenflavonoidernes anticancermekanisme blev udforsket, og forholdet mellem flavonoide stoffer og anticanceraktivitet blev analyseret for at skabe et teoretisk grundlag for anvendelse og udvikling af figenflavonoider i anticancermedicin.

Flavonoider er en række forbindelser, der består af to benzenringe forbundet med tre kulstofatomer. De har en C6-C3-C6-struktur, er uopløselige eller uopløselige i vand og er letopløselige i organiske opløsningsmidler som methanol, ethanol og ethylacetat. Derfor indeholder figenalkoholekstrakt og endda figenvin en vis mængde flavonoider og har anti-cancer-aktivitet. Med hensyn til antitumoreffekter brugte Bai et al. figenethanolekstrakt til intraperitonealt at injicere S180 faste tumorbærende mus og fandt ud af, at det havde en signifikant hæmmende effekt på sarkomvækst, øget organindeks og forbedret T-lymfocytprocent, hvilket tyder på, at figenethanolekstrakt kan have antitumoreffekter ved at forbedre immunfunktionen hos tumorbærende mus. Dette er den tidligste rapport om figenflavonoider, der hæmmer tumorer hos dyr. I dette eksperiment observerede vi, at flavonoider fra figenblade havde betydelig hæmmende aktivitet på spredningen af humane mavekræftceller SGC-7901, men havde relativt lave effekter på spredningen af mavekræft BGC-823 og leverkræft Hepg-2-celler (se figur 1). Ud fra de kræfthæmmende effekter fra blade indsamlet fra forskellige sorter i forskellige måneder kan man se, at hæmningen af flavonoider på SGC-7901-celler er højest i bladene fra 'Braunschweig' i august, mens hæmningen af flavonoider i blade fra andre sorter og måneder er relativt lav (se tabel 2). Det ser ud til, at kun flavonoider fra figenblade af specifikke sorter og måneder har en signifikant effekt på spredningen af specifikke tumorceller. Nogle mennesker har foreslået, at ethanolekstraktet af cicada cordyceps har den højeste hæmningsgrad på kræftcellers spredning i SGC-7901. Resultaterne af dette eksperiment svarer til dette. Efterhånden som koncentrationen af flavonoider i figenbladene steg, faldt antallet af mavekræftceller SGC-7901, blev kortere og rynkede, løsrev sig gradvist fra cellepladen, og den hæmmende effekt viste en dosiseffekt (se figur 2). Dette giver et teoretisk grundlag for at bestemme høsttidspunktet for figenblade og udvikle flavonoidernes anticancereffekt.
Vi brugte flowcytometri for første gang til at observere induktionen af celleapoptose af flavonoider i figenblade (se figur 3). Ved en flavonoidkoncentration på 200 μ g/mL var den samlede apoptoserate for celler 39,08%; da koncentrationen nåede 1600 μ g/mL, nåede den samlede apoptoserate op på 83,60%. Baseret på dette blev den semidødelige koncentration af figenflavonoider på SGC-7901-celler beregnet til at være 577 25 μ g/mL. Dette svarer til den semihæmmende koncentration på 653 μ g/mL, som Purnamasari et al. foreslog for Huh7it-leverkræftceller i figenmethanolekstrakt. De fandt ud af, at methanolekstraktet fra figenblade kan hæmme spredningen af leverkræftceller, fremme apoptose og føre til cellenekrose. Apoptose involverer aktivering, udtryk og regulering af en række gener, hovedsageligt inklusive endogene mitokondrieveje og eksogene dødsreceptorreguleringsveje. Faldet i mitokondriemembranpotentialet er et kendetegn ved tidlig mitokondrieafhængig apoptose. Garc í a-Zepeda et al. påviste, at resveratrol inducerer et fald i mitokondriemembranpotentialet i cellelinjer med livmoderhalskræft og fremmer apoptose af kræftceller. Dette eksperiment observerede, at figenflavonoider reducerede mitokondriemembranpotentialet i humane mavekræftceller SGC-7901 (se figur 4). Dette indikerer, at flavonoider i figenblade fremmer apoptose ved at fremkalde et fald i mitokondriemembranpotentialet i SGC-7901-celler.
Vi observerede også den hæmmende effekt af flavonoider i figenblade på kræftcellers cellecyklus og fandt ud af, at de hovedsageligt blokerer mitosen af SGC-7901-celler i S-fasen, med nogle i G2-fasen (se figur 5). Det er blevet rapporteret, at capsaicin kan blokere endometriecancerceller i S-fasen og forårsage en stigning i apoptoseraten. Ifølge forskningen er capsaicins anticancermekanisme at hæmme ekspressionen af cellecyklusafhængige proteinkinaser CDK2, CDK4 og CDK6-proteiner. Kunstigt syntetiserede flavonoide aminosyrederivater kan også hæmme G2/M-fasen i MGC-803-mavekræftcellecyklus, mens de nedregulerer udtrykket af det anti-apoptotiske protein Bcl-2 og opregulerer udtrykket af det pro-apoptotiske protein Bax og derved udløser celleapoptose. Dette eksperiment analyserede mekanismen bag figenflavonoidernes hæmning af apoptose i SGC-7901-celler på mRNA-niveau. Vi fandt, at udtrykket af CDK1-, CDK2-, CDK6- og CyclinD1-gener i SGC-7901-celler behandlet med flavonoider fra figenblade faldt betydeligt, mens udtrykket af E2F1 steg (se figur 6B). I forskellige tumorvæv er CDK'er i en unormalt aktiveret tilstand, og hæmning af CDK-ekspression kan undertrykke ukontrolleret tumorproliferation. Desuden påvirkede behandling med flavonoider i figenblade også udtrykket af tumorundertrykkende gener P53 og Bax samt onkogenet Bcl-2 (se figur 6A). Blandt disse tre gener hører Bax og Bcl-2 til den samme genfamilie. Blandt dem fremmer Bcl-2 cellecyklussen, mens Bax og Bcl-2 danner en proteindimer, der modvirker sidstnævntes aktivitet, hæmmer cellecyklussen og forårsager celleapoptose. Ifølge rapporter kan flavonoider fra Tianshan Snow Lotus opregulere udtrykket af CaEs-17Bax og nedregulere udtrykket af Bcl-2 i humane spiserørskræftceller og derved fremkalde celleapoptose. Flavonoiderne i figenbladene fremmer udtrykket af tumorsuppressorgenerne P53 og Bax, mens de hæmmer udtrykket af tumorsuppressorgenet Bcl-2. Dette tyder på, at den apoptosefremkaldende effekt af figenbladsflavonoider på mavekræftcellelinjen SGC-7901 kan opnås ved at regulere udtrykket af apoptoserelaterede gener Bax, P53 og Bcl-2.
For at undersøge de specifikke aktive ingredienser i figenbladsflavonoider, der hæmmer spredningen af mavekræftceller SGC-7901, udvalgte vi tre prøver ('Branrick' i august, 'Masyutaofen' i september og 'Bojihong' i september) til kvalitativ og kvantitativ LCMS/MS-analyse baseret på de forskellige hæmmende virkninger af figenbladsflavonoider på spredningen af mavekræftceller SGC-7901 hos mennesker i forskellige sorter og måneder. Efter screening blev der opnået 12 differentierede metabolitter, der var stærkt korreleret med kræftinhiberingshastigheden (se tabel 3). Blandt dem er der en meget signifikant positiv sammenhæng mellem narcissins og figenflavonoiders kræfthæmmende virkning. Det er blevet rapporteret, at narcissosid har antiviral aktivitet og også er af stor betydning for forebyggelse og behandling af proteinkonformationssygdomme som Alzheimers sygdom, type II-diabetes, Parkinsons sygdom osv. For nylig blev det foreslået, at narcissosid kunne bruges til at forebygge og behandle COVID-19. Det er dog endnu ikke undersøgt, om det har kræfthæmmende virkninger. Resultaterne i tabel 3 viser også en signifikant sammenhæng mellem isoquercetin og figenflavonoidernes kræfthæmmende virkning. Det er blevet rapporteret, at isoquercetin kan hæmme udtrykket af miR-23a i gliomvæv betydeligt og derved undertrykke kræftcelleproliferation. Derfor fortjener forholdet mellem isoquercetin i figenblade og antitumoraktivitet yderligere undersøgelse. For det tredje kan melanin hæmme væksten af tumorceller og forekommer i S-fasen af cellecyklussen. Men nogle mener også, at blokaden sker i G2/M-fasen. Denne undersøgelse påviste også tilstedeværelsen af melanin, og korrelationskoefficienten mellem dets indhold og anti-cancer-rate var r= 9923, P=0,08. Selv om den ikke nåede 0,05-niveauet, er den meget tæt på. Desuden observerede vi, at flavonoider fra figenblade hæmmede cellecykluseffekten af SGC-7901-celler i S-fasen. Dette svarer til tidligere resultater. Da figner tilhører Ficus-slægten i Moraceae-familien, er det værd at undersøge nærmere, om dette flavonoide stof er relateret til fignernes anticancer-aktivitet. Derudover observerede vi også 2 Indholdet af 6-dihydroxybenzoesyre, vanillophenon, cyanidin-3-O-rutinosidklorid, anthocyaniner, epicatechin, sinapin osv. var signifikant korreleret med figenflavonoidernes kræfthæmmende virkning (se tabel 3). Det er blevet rapporteret, at catechiner har en hæmmende effekt på leverkræft hos mennesker. I dette eksperiment observerede vi imidlertid, at den hæmmende effekt af figenbladsflavonoider på leverkræft HepG-2 var relativt lav (se figur 1), hvilket tyder på, at dens hæmmende effekt på SGC-7901 muligvis ikke er relateret til epicatechin. Forholdet mellem andre metabolitter og anticancereffekter er i øjeblikket sjældent rapporteret.
Sammenfattende analyserede denne artikel først flavonoidernes hæmmende effekt på spredningen af forskellige kræftcellelinjer i bladene af tre sorter, herunder 'Branrick', 'Masyutaofen' og 'Bojihong', fra juli til november. Det viste sig, at figensorten 'Branrick' havde den højeste hæmningsgrad af flavonoider på SGC-7901 mavekræft i august. Når koncentrationen af flavonoider stiger, falder tætheden og vedhæftningen af kræftceller, antallet af levende celler falder, og andelen af døde celler og sent apoptotiske celler stiger. Forskning i mekanismen for kræfthæmning har vist, at flavonoider fra figenblade blokerer cellecyklussen i S-fasen og en lille mængde i G2-fasen. Cellernes mitokondrielle membranpotentiale falder markant, og ekspressionsniveauerne for de pro-apoptotiske gener Bax og p53 samt det cellecyklusregulerende gen E1F2 øges markant. Ekspressionsniveauerne af det anti-apoptotiske gen Bcl-2 samt cellecyklusrelaterede gener Cy-clinD1 og CDK'er falder markant. Dette er vigtige mekanismer, hvormed flavonoider fra figenblade fremmer apoptose af kræftceller. Desuden har vi ved hjælp af LC-MS/MS-teknologi og tilhørende analyser screenet flere forskellige metabolitter, der er stærkt korreleret med kræfthæmning, såsom narcissin, isorhamnosid og morbærpigment. Dette åbner op for nye horisonter for udvikling af kræftmedicin til figenblade i fremtiden.