Oleuropeinin selülaz hidrolizinin doğal ötektik çözücüler tarafından teşvik edilmesi üzerine çalışma
Olea europaea L., Oleaceae familyasına ve Oleaceae cinsine ait bir bitkidir. Akdeniz bölgesinde önemli bir yağ bitkisidir ve Gansu ve Yunnan Çin'de zeytin için ana ekim alanlarıdır. Zeytin yaprakları, zeytin ağacı yetiştiriciliğinin ucuz bir yan ürünüdür. Her zeytin ağacının her yıl yaklaşık 25 kg yaprak kesmesi gerekir ve hasat edilen yaprakların toplam ağırlığı zeytinin toplam ağırlığının 10%'sini oluşturur. Zeytin yaprakları çeşitli biyoaktif bileşikler içerir. Örneğin oleanolik asit, alıç asidi, ursolik asit, oleuropein, hidroksitirosol vb.
Araştırmalar, oleuropeinin zeytin ağaçlarının tüm kısımlarına dağıldığını ve en yüksek içeriğin zeytin yapraklarında bulunduğunu göstermiştir. Kuru zeytin yapraklarında oleuropein içeriği 10% ila 17%'ye ulaşabilir. Şekil 1'de gösterildiği gibi, oleuropein hidrolize olarak hidroksitirosol, glikoz ve olenik asit üretir. Bunlar arasında hidroksitirosol, oleuropeinden daha iyi biyolojik aktivite sergiler. Şu anda, oleuropeinin hidroliz yöntemleri temel olarak asit hidrolizi, alkali hidroliz ve enzimatik hidrolizi içermektedir. Asit hidrolizi ve alkalin hidrolizi, katı reaksiyon koşullarına sahip güçlü asitler, güçlü bazlar ve yüksek sıcaklık ortamları gerektirir. Son yıllarda, yan ürünlerin biyotransformasyonu için katalizör olarak enzimlerin kullanımı dikkat çekmektedir. Geleneksel asit-baz hidroliz yöntemleriyle karşılaştırıldığında, oleuropeinin enzimatik hidrolizi, hafif reaksiyon koşulları ve daha az çevre kirliliği avantajlarına sahiptir. Liu ve arkadaşları, glikozidik bağları kırmak ve oleuropeini hidrolize ederek hidroksitirosol elde etmek için bir gıda katkı maddesi olarak selülaz kullanmıştır. Selülazın termal kararsızlığı nedeniyle, enzimin optimum sıcaklığında sürekli olarak yüksek aktiviteyi koruyamaz, bu da düşük enzimatik hidroliz verimliliğine neden olur. Bu nedenle, oleuropeinin çözünürlüğünü artırabilen ve uzun süreli reaksiyonlarda selülazın stabilitesini artırabilen ve böylece oleuropeinin enzimatik hidroliz verimliliğini artırabilen tampon çözeltinin yerini alacak yeni bir yeşil çözücü bulmaya çalışıyoruz.
Derin ötektik çözücüler (DES), hidrojen bağı alıcıları (HBA) ve hidrojen bağı donörlerinin (HBD) yüksek sıcaklıkta karıştırılmasıyla oluşan, tek tek bileşenlere kıyasla daha düşük erime noktalarına sahip homojen ve şeffaf karışımlardır. Düşük yanıcılık, düşük uçuculuk, kolay hazırlama, yüksek çözünürlük ve enzimlerle yüksek uyumluluk gibi mükemmel fiziksel ve kimyasal özellikleri nedeniyle DES, toksik olmayan bir ekstraktant ve çözünürleştirici olarak giderek daha fazla kullanılmaktadır. En önemli şey, enzimlerin organik çözücülerde deaktivasyona eğilimli olması ve DES'in bir çözücü olarak bu fenomenin meydana gelmesini önleyebilmesidir. Bu aynı zamanda DES'in organik çözücülerin yerini almasını ve selülazları inkübe etmesini mümkün kılar. Doğal HBA ve HBD'den oluşan DES, geleneksel DES'ten daha güvenli ve daha çevreci olan NADES olarak adlandırılır. NADES, enzim katalizli reaksiyonlar alanında yeşil bir çözücü olarak yaygın ilgi görmüştür. NADES, belirli enzimatik reaksiyonlarda başarıyla uygulanmış ve hem enzim aktivitesi hem de stabilitesi üzerinde olumlu etkiler yaratmıştır. Yukarıdaki araştırma sonuçları, NADES'in oleuropeinin selülaz hidrolizi için iyi bir çözücü olma potansiyeline sahip olduğunu göstermektedir.
Bu çalışmada, HBA olarak kolin klorür veya betain ve HBD olarak farklı poliol türleri kullanılarak altı tip NADES hazırlanmış ve bunların oleuropeinin selülaz hidrolizi üzerindeki etkileri araştırılmıştır. Farklı NADES türlerinin ve konsantrasyonlarının ve bunların monomerlerinin enzimatik hidroliz hızı üzerindeki etkileri araştırılarak, oleuropeinin selülaz hidrolizi için yeni, verimli ve yeşil bir yöntem oluşturulmuştur.

Bu çalışmada, tampon çözeltiye farklı tip ve konsantrasyonlarda NADES eklenerek NADES'in oleuropeinazın hidroliz hızı üzerindeki etkisi araştırılmıştır. Uygun NADES türü ve konsantrasyonunun seçilmesinin selülazın stabilitesini artırabileceği ve oleuropeinazın hidrolizini teşvik edebileceği bulunmuştur. 50°C sıcaklık ve pH=5 koşulları altında, 10% DES-5 (V/V) çözücü sisteminde oleuropeinazın hidroliz oranı, 3 saat hidrolizden sonra tampon çözeltinin 1,7 katıydı; 36 saatlik hidrolizden sonra enzimatik hidroliz oranı tampon çözeltinin 1,5 katıdır; Hafif, verimli ve çevre dostu enzimatik hidroliz koşulları temelinde, bu yöntem selülazın oleuropeini uzun süre verimli bir şekilde hidrolize etmesini mümkün kılar. Bu çalışmada, selülazın stabilitesini artırmak ve oleuropeinazın hidrolizini teşvik etmek için NADES'te HBA olarak kolin klorür veya betain ve HBD olarak polioller kullanılmış ve oleuropeinaz hidroliz ürünlerinin verimli bir şekilde hazırlanması için bilimsel bir temel sağlanmıştır.