Undersøgelse af fremme af cellulasehydrolyse af oleuropein med naturlige eutektiske opløsningsmidler
Olea europaea L. er en plante, der tilhører Oleaceae-familien og Oleaceae-slægten. Det er en vigtig olieafgrøde i Middelhavsområdet, og Gansu og Yunnan er de vigtigste områder for olivendyrkning i Kina. Olivenblade er et billigt biprodukt ved dyrkning af oliventræer. Hvert oliventræ har brug for at trimme ca. 25 kg blade hvert år, og den samlede vægt af høstede blade udgør 10% af den samlede vægt af oliven. Olivenblade indeholder forskellige bioaktive forbindelser. Såsom oleanolsyre, tjørninsyre, ursolsyre, oleuropein, hydroxytyrosol osv.
Forskning har vist, at oleuropein findes i alle dele af oliventræer, og at det højeste indhold findes i olivenblade. I tørre olivenblade kan indholdet af oleuropein nå op på 10% til 17%. Som vist i figur 1 hydrolyseres oleuropein til hydroxytyrosol, glukose og olensyre. Blandt dem udviser hydroxytyrosol bedre biologisk aktivitet end oleuropein. På nuværende tidspunkt omfatter hydrolysemetoderne for oleuropein hovedsageligt syrehydrolyse, alkalisk hydrolyse og enzymatisk hydrolyse. Syrehydrolyse og alkalisk hydrolyse kræver stærke syrer, stærke baser og miljøer med høj temperatur og strenge reaktionsbetingelser. I de senere år har brugen af enzymer som katalysatorer til biotransformation af biprodukter fået opmærksomhed. Sammenlignet med traditionelle syre-base-hydrolysemetoder har enzymatisk hydrolyse af oleuropein fordelene ved milde reaktionsbetingelser og mindre miljøforurening. Liu et al. brugte cellulase som fødevaretilsætningsstof til at bryde glykosidbindinger og hydrolysere oleuropein for at opnå hydroxytyrosol. På grund af cellulasens termiske ustabilitet kan den ikke opretholde høj aktivitet kontinuerligt ved enzymets optimale temperatur, hvilket resulterer i lav enzymatisk hydrolyseeffektivitet. Derfor forsøger vi at finde et nyt grønt opløsningsmiddel til at erstatte bufferopløsningen, som kan øge opløseligheden af oleuropein og forbedre cellulasens stabilitet i langtidsreaktioner og dermed forbedre den enzymatiske hydrolyseeffektivitet af oleuropein.
Dybe eutektiske opløsningsmidler (DES) er homogene og gennemsigtige blandinger dannet ved højtemperaturomrøring af hydrogenbindingsacceptorer (HBA) og hydrogenbindingsdonorer (HBD) med lavere smeltepunkter sammenlignet med de enkelte komponenter. På grund af sine fremragende fysiske og kemiske egenskaber, herunder lav brændbarhed, lav flygtighed, nem fremstilling, høj opløselighed og høj kompatibilitet med enzymer, bruges DES i stigende grad som et ikke-giftigt ekstraktionsmiddel og opløsningsvæske. Det vigtigste er, at enzymer er tilbøjelige til at blive deaktiveret i organiske opløsningsmidler, og DES som opløsningsmiddel kan forhindre dette fænomen i at opstå. Det gør det også muligt for DES at erstatte organiske opløsningsmidler og inkubere cellulaser. DES, der består af naturlig HBA og HBD, kaldes NADES, som er sikrere og grønnere end konventionel DES. NADES har fået stor opmærksomhed som et grønt opløsningsmiddel inden for enzymkatalyserede reaktioner. NADES er med succes blevet anvendt i specifikke enzymatiske reaktioner og har haft en positiv effekt på både enzymaktivitet og -stabilitet. Ovenstående forskningsresultater viser, at NADES har potentiale til at blive et godt opløsningsmiddel til cellulasehydrolyse af oleuropein.
Denne undersøgelse fremstillede seks typer NADES ved hjælp af cholinklorid eller betain som HBA og forskellige typer polyoler som HBD og undersøgte deres virkning på cellulasehydrolyse af oleuropein. Ved at udforske effekten af forskellige typer og koncentrationer af NADES og deres monomerer på den enzymatiske hydrolysehastighed blev der konstrueret en ny effektiv og grøn metode til cellulasehydrolyse af oleuropein.

Dette studie undersøgte effekten af NADES på hydrolysehastigheden af oleuropeinase ved at tilsætte forskellige typer og koncentrationer af NADES til bufferopløsningen. Det viste sig, at valg af den rette type og koncentration af NADES kan øge stabiliteten af cellulase og fremme hydrolysen af oleuropeinase. Under betingelser med en temperatur på 50 °C og pH=5 var hydrolysehastigheden for oleuropeinase i et 10% DES-5 (V/V)-opløsningsmiddelsystem 1,7 gange bufferopløsningens efter hydrolyse i 3 timer; Den enzymatiske hydrolysehastighed efter 36 timers hydrolyse er 1,5 gange bufferopløsningens; På basis af milde, effektive og miljøvenlige enzymatiske hydrolysebetingelser gør denne metode det muligt for cellulase at hydrolysere oleuropein effektivt i lang tid. Denne undersøgelse anvendte cholinklorid eller betain som HBA og polyoler som HBD i NADES for at forbedre stabiliteten af cellulase og fremme hydrolysen af oleuropeinase, hvilket giver et videnskabeligt grundlag for effektiv fremstilling af oleuropeinase-hydrolyseprodukter.