PI3K/AKT/mTOR yolağına dayalı üç yüz çubuk, lipopolisakkarit kaynaklı otofajiyi teşvik eder ve RAW264.7 hücrelerinde enflamasyonu engeller
Lipopolisakkarit (LPS), Gram negatif bakteriler tarafından salınan bir endotoksindir ve insan vücudundaki Gram negatif bakteriyel enfeksiyonların neden olduğu bakteriyel toksisitede immün inflamatuar yanıtları uyarabilir. Makrofajlar genellikle enflamatuar yanıtlara ve fagositoza katılır ve LPS ile muamele edilmiş makrofaj hattı RAW 264.7, bağışıklık hücresi enflamatuar yanıtları için yaygın olarak kullanılan bir hücre modelidir. Otofaji, sitoplazmik içeriklerin otofagozomlar tarafından lizozomlara taşınarak hücresel homeostazın korunması için kapsamlı bir şekilde parçalandığı katabolik bir süreçtir. Otofaji, önemli bir hücresel mekanizma olarak, otoimmün hastalıklar, enflamatuar hastalıklar ve tümörler gibi çeşitli hastalıkların oluşumunda ve gelişiminde rol oynar. Enflamatuar yanıt, vücut dokularının bir tür bağışıklık savunma işlevidir. Ilımlı inflamatuar yanıt vücut hasarının onarılmasına yardımcı olur, ancak aşırı inflamatuar yanıt vücutta olumsuz reaksiyonlara yol açarak organların, dokuların ve hücrelerin dejenerasyonuna ve nekrozuna neden olabilir ve hatta yaşamı tehlikeye atabilir. Birçok çalışma otofaji ve enflamasyon arasında çift yönlü bir iletişim olduğunu ortaya koymuştur. Ilımlı otofaji enflamatuar yanıtı zayıflatabilir, ancak aşırı otofaji enflamatuar yanıtı şiddetlendirebilir. Çoklu bağışıklık aracıları otofajiyi indükleyebilir veya inhibe edebilir, ancak homeostazının restorasyonu büyük ölçüde otofajiye dayanır. Bu nedenle, otofajinin enflamasyon üzerindeki düzenleyici mekanizmasının tam olarak anlaşılması, enflamatuar ve otoimmün hastalıkları etkili bir şekilde tedavi edebilir.
Üç yüz çubuk, Rutaceae familyasından bir bitki olan Toddalia asiatica (L.) Lam'ın kökünden elde edilir. "Tujia Tıbbi Kayıtları", "rüzgar ve rutubeti giderme, kan dolaşımını teşvik etme ve tendonları rahatlatma, şişliği azaltma ve ağrıyı hafifletme" etkilerini açıkça kaydetmektedir. Kimyasal bileşim çalışmaları Sanbai çubuğunun ana kimyasal bileşenlerinin alkaloidler ve kumarinler olduğunu göstermiştir. Modern farmakolojik araştırmalar, Sanbai çubuğu özütünün anti romatizmal, anti-inflamatuar, anti-tümör ve diğer etkilere sahip olduğunu doğrulamıştır. Ön deneysel araştırmalarımız Sanbai çubuğunun fosfatidilinositol 3-kinaz/protein kinaz B/mammalian rapamycin hedef proteini (PI3K/AKT/mTOR) sinyal yolu aracılığıyla otofaji akışını engelleyebildiğini ve böylece fibroblast hücre hattı MH7A'nın proliferasyonunu inhibe ettiğini ve apoptozunu indüklediğini göstermiştir. Bununla birlikte, Toddalia asiatica alkol ekstraktının (TAAE) otofajideki rolü hala olgunlaşmamıştır. Bu çalışmanın sonuçları, TAAE'nin otofajiyi konsantrasyona bağlı bir şekilde tetiklediğini göstermiştir. TAAE'nin PI3K/AKT/mTOR yolu aracılığıyla RAW 264.7 makrofajlarının otofajisinde önemli bir rol oynayıp oynamadığını daha fazla doğrulamak için, bu deneyde TAAE'nin otofaji ve RAW 264.7 hücrelerinin bağışıklık fonksiyonu üzerindeki etkilerini araştırmak ve TAAE'nin doğuştan gelen bağışıklık tepkisini düzenlemesinin moleküler mekanizmasını keşfetmek için bir model olarak LPS ile uyarılmış RAW 264.7 hücreleri kullanılmıştır.

Makrofajlar insan vücudundaki önemli bağışıklık hücrelerinden biridir. İnsan dokularını ve kanını istila eden patojenlere karşı stres durumlarını hızla aktive ederek bir dizi enflamatuar reaksiyona yol açabilirler. Enflamasyonun oluşumu ve gelişimi ile yakından ilişkili önemli doğuştan gelen bağışıklık hücreleridir. Enflamasyon, dış yaralanma veya enfeksiyona maruz kalındığında bağışıklık sisteminin çeşitli fiziksel reaksiyonlarının neden olduğu karmaşık bir patolojik reaksiyondur. Nörodejeneratif hastalıklar, romatoid artrit, arterioskleroz gibi birçok kronik hastalığın patofizyolojisinin önemli bir parçasıdır. Bir çalışma, TAAE'nin Toll benzeri reseptör 4/nükleer faktör - κ B (TLR4/NF - κ B) yolunu inhibe edebildiğini, böylece sıçanların sinovyumunda (CIA) kolajen kaynaklı enflamatuar sitokinlerin interlökin-1 β (IL-1 β) ve tümör nekroz faktörü - α (TNF - α) ekspresyonunu azalttığını, romatoid artrit sinovitini inhibe ettiğini ve romatoid artritin ilerlemesini baskıladığını bulmuştur. TAAE ayrıca NF - κ B'nin nükleer girişini inhibe edebilir, böylece enflamatuar faktörlerin salınımını bastırır ve sinovyal proliferasyonu inhibe eder. Yang ve arkadaşları, 300 çubuktan elde edilen etanol ekstraktının ve etil asetat ekstraktının CIA sıçan modellerinde eklem şişmesini önleyebildiğini, TNF - α, IL-1 β ve interlökin-6 (IL-6) gibi pro-enflamatuar faktörleri azaltabildiğini ve serumda immünosupresif faktör interlökin-10 (IL-10) ekspresyonunu artırabildiğini bulmuştur. Yukarıdakilerin tümü, üç yüz çubuğun mükemmel anti-enflamatuar ve anti romatizmal etkilerini göstermektedir.

Otofaji, ökaryotik hücrelerin otofaji ile ilgili genlerin düzenlemesi altında kendi sitoplazmik proteinlerini ve hasarlı organellerini bozmak için lizozomları kullandığı bir süreçtir. Bu süreç, istilacı patojen mikroorganizmaları, hasarlı organelleri ve anormal şekilde birikmiş proteinleri bozarak hücre kalite kontrolü, metabolizma ve doğuştan gelen ve uyarlanabilir bağışıklık gibi biyolojik süreçlerde önemli bir rol oynayabilir. Birçok çalışma otofajinin enflamasyon üzerinde çift yönlü bir etkisi olduğunu doğrulamıştır: bir yandan otofaji, enflamatuar protein agregatlarını ortadan kaldırarak ve doku hasarına neden olan pro-enflamatuar sitokinleri aşağı doğru düzenleyerek enflamatuar tepkilere karşı koyabilir; diğer yandan otofaji enflamazomları aktive ederek büyük miktarda enflamatuar faktör üretir ve böylece enflamatuar süreci hızlandırır. Bağışıklık ve inflamasyonun olumlu ve olumsuz yönlerini dengeledikten sonra otofaji, enfeksiyon, otoimmünite ve inflamasyonun koruyucusu olarak görülebilir. Mikrotübül ilişkili protein hafif zincir 3-II (LC3-II), otofajinin ayırt edici bir proteinidir. Otofaji sırasında LC3-I, LC3-II'yi oluşturmak için Atg5-Atg12-Atg16 kompleksinin yardımıyla bir fosfatidiletanol molekülüne bağlanır. P62, otofajik yıkım için bir substrattır ve yıkılan substratların tanınmasında ve kapsüllenmesinde çok önemli bir rol oynar. Beclin1 memeli hücrelerinde aşırı eksprese edildiğinde, hücresel otofajiyi teşvik eder. Bu nedenle, LC3, Beclin1, P62 ve Atg5 otofaji için işaretleyici proteinler olarak hizmet edebilir. TAAE tarafından sergilenen anti-enflamatuar etkinin otofaji ile ilişkili olup olmadığını araştırmak için, bu çalışmada otofaji ile ilişkili proteinler P62, Beclin1, Atg5 ve LC3'ün yanı sıra enflamasyonla ilişkili proteinler TNF - α, IL-6 ve siklooksijenaz-2'nin (COX-2) protein ekspresyonunu tespit etmek için Western blot kullanılmıştır. Deneysel sonuçlar, TAAE müdahalesinden sonra Beclin1, Atg5 ve LC3-II/LC3- protein ekspresyon seviyelerinin kademeli olarak arttığını, substrat P62 proteininin ekspresyon seviyesinin kademeli olarak azaldığını ve enflamasyonla ilgili proteinlerin ekspresyonunun da azaldığını göstermiştir. Otofagozomları etiketlemek için MDC yönteminin ve otofagozomları gözlemlemek için transmisyon elektron mikroskobunun kullanıldığı deneysel sonuçlar da TAAE'nin RAW 264.7 hücrelerinde otofajiyi teşvik ettiğini göstermiştir. Otofajinin enflamasyon üzerindeki etkisini daha fazla göstermek için, PI3K sinyal yolunun spesifik bir inhibitörü olan otofaji inhibitörü 3-MA, makrofaj otofajisini kontrol etmek, otofajik şelasyonu ve protein yıkımını engellemek için kullanılmıştır. Sonuçlar, otofaji inhibitörü 3-MA'nın TAAE'nin enflamatuar sitokinler üzerindeki inhibitör etkisini zayıflattığını gösterirken, TAAE müdahalesinin enflamatuar modelde TNF - α ve IL-6 sitokinlerinin salgılanmasını etkili bir şekilde azaltabildiğini ve TAAE'nin RAW 264.7 hücrelerinde otofajiyi teşvik ederek anti-enflamatuar etkiler gösterdiğini bir kez daha ortaya koymuştur.

PI3K/AKT/mTOR sinyal yolu, otofaji regülasyonunda önemli bir rol oynar ve PI3K/AKT/mTOR yolu inhibe edildiğinde otofaji seviyeleri artar. MTOR, rapamisinin memeli hedefidir ve otofaji yanıtında önemli bir düzenleyici rol oynar ve otofajinin önemli bir negatif düzenleyici ekseni olarak hizmet eder. Birçok doğal ürünün PI3K/AKT/mTOR aracılı otofajiyi hedef alarak inflamasyon ve otoimmün hastalıkları engellediği gösterilmiştir. Önceki deneyler, TAAE'nin PI3K/AKT/mTOR sinyal yolu aracılığıyla otofajik akışı engelleyebildiğini ve MH7A hücrelerinin apoptozunu teşvik edebildiğini doğrulamıştır. PI3K/AKT/mTOR sinyal yolu Western blotlama ile doğrulanmış ve deneysel veriler TAAE'nin fosforile PI3K, AKT ve mTOR ekspresyon seviyelerini önemli ölçüde azalttığını göstermiştir; bu da TAAE'nin PI3K/AKT/mTOR yolunu inhibe ederek otofajiyi tetiklediğini göstermektedir. PI3K agonistinin (740Y-P) eş zamanlı kullanımı da TAAE'nin PI3K/AKT/mTOR sinyal yolunu inhibe ederek otofajiyi tetiklediğini göstermiştir. Ayrıca, PI3K/AKT/mTOR sinyal yolu doğrudan enflamasyon ve bağışıklık ile ilişkilidir. Bu çalışmada, TAAE tedavisinin LPS ile indüklenen RAW 264.7 hücrelerinde pro-enflamatuar sitokin seviyelerini azalttığı bulunmuştur. Bu çalışma, RAW 264.7 hücrelerinin LPS ile indüklenen enflamatuar ortamında, TAAE'nin otofaji ile ilgili PI3K/AKT/mTOR yolunu inhibe ettiğini, otofaji ile ilgili proteinleri ve enflamatuar faktörleri düzenlediğini, otofagozom lizozom füzyonunu ve degradasyonunu teşvik ettiğini, enflamatuar hücrelerin homeostazını etkilediğini, enflamatuar yanıtları inhibe ettiğini ve böylece anti-enflamatuar etkiler gösterdiğini ortaya koymaktadır. Bu çalışmanın sonuçları, PI3K/AKT/mTOR'un TAAE'nin anti-enflamatuar etkiler göstermesi ve otofajik aktiviteyi artırması için etkili bir yol olduğunu, bunun da enflamasyonla ilgili otoimmün ve metabolik hastalıkların klinik tedavisi için yeni fikirler sağlayabileceğini ve daha derinlemesine araştırmaya değer olduğunu göstermektedir.