Фенол Шанна регулирует путь AMPK/NOX4, подавляя индуцированный высокой глюкозой окислительный стресс и накопление внеклеточного матрикса в гломерулярных мезангиальных клетках
Диабетическая нефропатия (ДН) - микрососудистое осложнение сахарного диабета и важная причина почечной недостаточности в конечной стадии. Ненормальная функция гломерулярных мезангиальных клеток (ГМК) может способствовать патологическим и физиологическим изменениям при диабетической нефропатии. В условиях патологии почек длительная гипергликемия приводит к накоплению в организме большого количества реактивных форм кислорода (ROS), которые активируют сигнальные реакции на глюкозу, способствуют накоплению внеклеточного матрикса (ECM) и непосредственно стимулируют аномальную пролиферацию ГМК. Это позволяет предположить, что вмешательство в процессы окислительного стресса (ОС) и накопления ЭКМ в ГМЦ может стать эффективной стратегией профилактики диабетической нефропатии.

ДН имеет множество механизмов патогенеза, среди которых ОС является ключевым патогенетическим фактором ДН, вызванным повышенным уровнем РОС. Семейство восстановленных никотинамид аденин динуклеотид фосфатов (NADPH) (NOX 1-5 и Duox 1-2) переносит электроны на молекулы кислорода через плазматическую мембрану, генерируя ROS, что является одним из основных источников ROS при ДН. NADPH-оксидаза 4 (NOX4) является высокоэкспрессированным подтипом NADPH в почках пациентов с ДН и является основной причиной индуцированной высокой глюкозой продукции ОС в ГМЦ. Повышенный уровень NOX4 может непосредственно вызывать гломерулярный фиброз. Подавление экспрессии NOX4 ослабляет расширение гломерулярной мембраны, гломерулосклероз и накопление ЭЦМ. Выявление молекулярного механизма индуцированного высокой глюкозой повышения экспрессии NOX4, а также вовлеченных в этот процесс эффекторных факторов верхнего и нижнего течения имеет большое значение.

Фосфорилирование 5'-аденозинмонофосфат активированных протеинкиназ (AMPK) может блокировать экспрессию NOX4, вызванную высоким содержанием глюкозы, и подавлять аномальную пролиферацию и активацию почечных фибробластов. Сестрины - важное семейство стресс-индуцированных белков, играющих решающую роль в поддержании стабильности клеточной среды. Sestrin2 является одним из важнейших представителей семейства и играет критическую роль в защите клеток от окислительного повреждения путем активации фосфорилирования AMPK. Кроме того, AMPK может быть негативным регулятором активации NOX, поскольку активация Sestrin2 и AMPK может подавлять ROS и защищать ГМК от инвазии ОС, что указывает на то, что активация Sestrin2 и фосфорилирование AMPK могут оказывать профилактическое действие на ДН.

Доказано, что накопление ОС и ЭЦМ играет важную роль в патогенезе диабетической нефропатии, поэтому особенно актуальным является поиск средств традиционной китайской медицины и натуральных продуктов с антиоксидантным действием и ослабленным эффектом ДН. Флавоноиды привлекают все большее внимание ученых благодаря своей превосходной эффективности. Каемпферол (KAE) - флавоноидное соединение, обладающее множеством фармакологических свойств. KAE уменьшает повреждение сердца, вызванное высоким уровнем сахара в крови, путем ингибирования воспалительной реакции и ОС; ингибируя воспалительную сигнализацию, опосредованную RhoA/Rho киназой, можно улучшить ДН. В настоящее время существует относительно мало исследований, посвященных влиянию KAE на ОС и накопление ЭКМ в ГМК, вызванные высоким содержанием глюкозы, путем регулирования пути AMPK/NOX4. В данном исследовании использовалась модель ГМЦ in vitro с высоким содержанием глюкозы для изучения влияния KAE на накопление ОС и ЭКМ в ГМЦ, индуцированных высоким содержанием глюкозы, и его защитного механизма против ДН.

Повышенный уровень глюкозы в крови считается ключевым фактором нарушения функции почек и патологических изменений при диабетической нефропатии. Ввиду сходства фенотипа мезангиальных клеток, культивируемых в условиях ГГ и у пациентов с ДН, в данном эксперименте мы исследовали защитный эффект KAE на индуцированное ГГ повреждение ГМЦ in vitro. Результаты показали, что KAE ингибировал индуцированную HG пролиферацию клеток ГМК, ОС и накопление ECM, регулируя путь AMPK/NOX4.

Ранними признаками ДН являются аномальная пролиферация мезангиальных клеток и избыточное отложение ЭЦМ, что обычно приводит к пролиферации мезангиальных клеток, почечному фиброзу и поражению почек в конечной стадии. Коллаген, фибронектин (ФН) и ламинин - основные компоненты ЭЦМ, которые в основном синтезируются при стимуляции высоким содержанием глюкозы в крови. В ДН TGF - β 1 является ключевым цитокином, участвующим в накоплении почечного ЭЦМ. В нормальных физиологических условиях различные клетки организма могут выделять неактивный TGF - β 1; в условиях высокого содержания глюкозы неактивный TGF - β 1 может переходить в активное состояние, способствуя накоплению гломерулярного ЭКМ путем увеличения экспрессии генов ЭКМ (таких как Col IV) и снижения деградации ЭКМ. Ингибирование TGF - β 1 может ослабить вызванные высоким содержанием глюкозы изменения в экспрессии генов ЭЦМ, тем самым уменьшая накопление ЭЦМ в ДН. Результаты показали, что в клетках GMCs, стимулированных высоким содержанием глюкозы, уровни мРНК и белка TGF - β 1 и Col IV были значительно повышены, а обработка KAE могла снизить их экспрессию, что указывает на то, что KAE может играть антидиабетическую роль, снижая накопление ECM и способствуя его деградации.

Патогенез ДН связан с возникновением ОС, которые могут активировать множество сигнальных путей в клетках и стимулировать транскрипционные факторы, что приводит к увеличению накопления ЭЦМ и снижению деградации матрикса. Индуцированная ОГ генерация ROS может нарушить баланс между оксидантами и антиоксидантами, нарушить работу систем антиоксидантной защиты и привести к повреждению ГМК. Исходя из этого, избыточная продукция ROS играет важную роль в патогенезе диабетической нефропатии. В патологических условиях клиренс ROS требует совместного участия ферментативных и неферментативных систем, таких как СОД и МДА. СОД - это антиоксидантный металлофермент, который играет важную роль в поддержании баланса между окислением и антиокислением, катализируя расщепление супероксид-анионов и перекиси водорода. МДА оказывает влияние на систему антиоксидантной защиты, поскольку уровень МДА напрямую коррелирует с уровнем перекисного окисления мембранных липидов в ГМК. Результаты показали, что KAE может повышать активность СОД и снижать содержание МДА в ГМЦ, индуцированных HG, что указывает на потенциальные антиоксидантные свойства KAE.

Трансдукция ROS и усиленная сигнализация глюкозы считаются важными патогенными факторами, способствующими развитию диабетической нефропатии. Существует множество источников ROS в почках, и подтип NADPH-оксидазы семейства NOX в основном связан с диабетической нефропатией. К настоящему времени исследования выявили семь подтипов семейства NOX, среди которых NOX4 высоко экспрессируется в гломерулах, подоцитах и тубулярных клетках крыс и мышей. В норме NOX4 связывается с трансмембранной субъединицей (p22phox), образуя активный комплекс, который отвечает за его биологическую функцию. Повышение NOX4 связано с увеличением содержания FN и TGF - β 1 в мезангиальных и тубулярных клетках, подвергшихся воздействию HG. NOX4 связан с TGF - β 1-индуцированным накоплением ECM в фибробластах, что способствует их дифференцировке в фибробласты фибротического фенотипа. Было показано, что NOX4 опосредует увеличение мезангиальной гипертрофии и повышение уровня FN при лечении ангиотензином II. Чрезмерное накопление ОС и ЭЦМ может привести к повреждению почек и считается одной из важных причин ДН. Для изучения взаимосвязи между накоплением ОС, ЭКМ и NOX использовали вестерн-блот и qRT ПЦР для измерения уровней белка и мРНК подтипов NOX4, высоко экспрессируемых при ДН. Исследования показали, что устранение активности NOX4 приводит к снижению ОС и ЭКМ в ГМК, индуцированных HG. Результаты данного эксперимента согласуются с предыдущими исследованиями. ГГ повышает экспрессию мРНК и белков NOX4 и p22phox, стимулируя генерацию ROS, TGF - β 1 и Col IV в ГМЦ. Использование KAE и сайленсинг NOX4 и p22phox может подавить накопление ОС и ЭКМ, что указывает на то, что антиоксидантный эффект KAE регулируется через NOX4/p22phox путь.

Семейство Sestrins состоит из группы стресс-индуцированных белков, участвующих в регуляции внутриклеточной стабильности, что является одним из механизмов антиоксидантной защиты и имеет две различные функции биологической активности. Во-первых, ингибирование накопления ROS для оказания антиоксидантного действия может включать регуляцию антиоксидантных факторов транскрипции. Во-вторых, сестрины действуют как ингибиторы обратной связи mTORC1, активируя AMPK или ингибируя Rag GTPases. AMPK - важный метаболический сенсор, широко экспрессирующийся почти во всех эукариотических клетках. Исследования показали, что в условиях HG Sestrin2 и активация AMPK подавляют NOX4-индуцированное накопление ROS в GMCs. Фосфорилирование AMPK ингибирует выработку ROS и накопление ECM в мезангиальных клетках человека. Кроме того, фосфорилирование AMPK может подавлять накопление TGF - β 1 в моче, подавлять разрастание мезангиального матрикса и уменьшать отложение коллагена в мышиных моделях ДН. Все больше исследований указывают на то, что AMPK тесно связан с активностью NOX при ДН. В этом эксперименте было обнаружено, что KAE значительно подавляет индуцированную HG пролиферацию клеток, выработку ROS, NOX4, TGF - β 1 и экспрессию Col IV за счет повышения активности AMPK. Кроме того, соединение C отменяло защитный эффект KAE на индуцированную HG ОС и отложение ECM в ГМК.

Таким образом, данное исследование показало, что KAE оказывает защитное действие на индуцированное HG накопление ОС и ЭКМ ГМЦ путем регуляции пути AMPK/NOX4. Предполагается, что KAE может стать потенциальным препаратом-кандидатом или ведущим соединением для профилактики и лечения ДН.