Скрининг новых противовирусных соединений из библиотеки натуральных продуктов традиционной китайской медицины на основе структуры мономеров гликопротеина вируса Эбола
Вирус Эбола (EBOV) - это оболочечный нитевидный вирус, вызывающий острую геморрагическую лихорадку, которая является зоонозным инфекционным заболеванием, обычно встречающимся у приматов, с уровнем смертности до 50% - 90%. В последние годы в Западной Африке произошло несколько вспышек тяжелой лихорадки Эбола, однако до сих пор не было одобрено к продаже ни одного специфического препарата для лечения геморрагической лихорадки Эбола. Проникновение EBOV в клетки хозяина - критический этап инфекции, опосредованный вирусным поверхностным трансмембранным гликопротеином EBOV sgP. Этот слитый белок I типа содержит две субъединицы, соединенные дисульфидными связями: GP1, находящийся на поверхности, и GP2, встроенный в вирусную мембрану. После связывания с клеткой хозяина через факторы прикрепления к клеточной поверхности вирус интернализуется, и соответствующие цистеиновые протеазы и протеазы в эндосоме расщепляют большую часть пептидных цепей субъединицы GP1, обнажая сайт связывания с рецептором. Этот конформационный переход GP способствует слиянию мембраны вируса-хозяина и последующему высвобождению вирусного генома. Этот механизм слияния сходен с механизмом слияния вируса ВИЧ-1 и вируса гриппа. Поэтому разработка молекул-ингибиторов, эффективно препятствующих конформационному переходу sgP EBOV, может помочь блокировать инвазию и репликацию вируса.

В 2019 году Элизабет Э. Фрай и ее команда с кафедры структурной биологии Оксфордского университета (Великобритания) успешно приготовили белок EBOV sgP с помощью технологии кристаллизации экспрессионной очистки белка и определили его трехмерную структуру с помощью рентгеновских дифракционных экспериментов (RCSB Protein Data Bank ID: 5JQ7), создав компьютерную виртуальную модель для скрининга. Кроме того, благодаря уникальной структуре и разнообразию природных продуктов, особенно библиотек ингредиентов традиционной китайской медицины, они использовались для лечения различных хронических и инфекционных заболеваний, а также могут быть использованы для поиска ингибиторов против вируса Эбола. Исходя из вышеизложенных соображений, в данном исследовании использована технология компьютерного моделирования для скрининга молекул ингибиторов EBOV sgP из библиотеки натуральных продуктов традиционной китайской медицины.

В 2017 году исследовательская группа Ахмада впервые изучила трехмерную структуру тримерных полостей трансмембранного гликопротеина EBOV-GP на основе библиотеки соединений Mcule（ https://mcule.com/database /Провела крупномасштабный виртуальный скрининг ингибиторов с помощью двух программ молекулярного докинга, Auto Dock Vina и Flex-X, в сочетании с онлайн-инструментом анализа admetSAR（ http://www.admetexp.org ） Была проведена фильтрацияADMET и найдены три молекулы-хиты. С 2000 года происходят постоянные вспышки вируса Эбола, и исследование и разработка противовирусных молекул остается горячей точкой глобальных фармацевтических исследований. Поэтому для поиска противовирусных активных молекул из библиотеки натуральных продуктов традиционной китайской медицины в данном исследовании были использованы идеи, изложенные в этой статье, изменена цель с тримера EBOV-GP на мономер и переработан экспериментальный метод многораундового виртуального скрининга. В стратегии скрининга используются более дорогие алгоритмы, чтобы максимально повысить точность предсказания, снизить процент ложноположительных результатов виртуального скрининга и лучше предсказать конформацию связывания. Кроме того, моделирование молекулярной динамики и расчет свободной энергии связывания также являются важными инструментами для изучения силы взаимодействия белков с ингибиторами. Для моделирования молекулярной динамики используется программа GROMACS, а для предсказания свободной энергии связывания системы после стабилизации - алгоритм MM/PBSA. Эти методы не только позволяют получить подробную информацию о взаимодействии белков с ингибиторами на атомном и молекулярном уровнях, но и способствуют выяснению структурного родства между комплексами белок-ингибитор.

Для эффективного вмешательства в конформационный переход EBOV sgP в данном исследовании мы нацелились на активную полость мономера EBOV GP и извлекли молекулы ингибиторов из библиотеки натуральных продуктов традиционной китайской медицины, чтобы блокировать слияние мембран вируса-хозяина. Во-первых, следуя пяти принципам Липински и трем принципам Вербера, отсеивались соединения, нарушающие принцип подобия лекарств; затем с помощью программы Glide проводились расчеты молекулярного докинга с тремя различными точностями, а именно высокопроизводительной HTVS, стандартной точности SP и сверхточной XP, постепенно уменьшая размер библиотеки соединений-кандидатов; затем программа QikDrop Шредингера использовалась для прогнозирования ADMET-свойств молекул-хитов и сравнивалась с admetSAR для стратегии фильтрации. Были добавлены два ключевых показателя для фармакокинетического анализа и анализа безопасности лекарств, включая гепатотоксичность HERG_IC50 и пероральную биодоступность. В сочетании с прогнозируемыми значениями Lipinski Ro5 и Verber Ro3 была проведена относительно полная оценка лекарственной привлекательности препарата; В процессе анализа режима связывания белков-мишеней с молекулами-хитами использовалась высокопроизводительная технология ускорения GPU для моделирования состояния движения биомолекул в условиях реального физиологического солевого растворителя. Моделирование молекулярной динамики проводилось в течение 50 нс, а алгоритмы MM/GBSA и MM/PBSA использовались для предсказания свободной энергии связывания и повышения точности обогащения. В итоге, на основании оценок XP Glide, RMSD, RMSF, энергии связывания MM/GBSA, энергии связывания MM/PBSA и прогноза ADME, хитовые молекулы MOL006834, MOL000174, MOL002192 и MOL012524 продемонстрировали превосходное сродство к активному сайту sgP EBOV и хорошие лекарственные свойства; Предсказать истинные конформации связывания хитовых молекул MOL006834, MOL000174, MOL002192, MOL012524 с трансмембранными гликопротеинами на атомном и молекулярном уровнях, включая водородные связи, гидрофобные взаимодействия, ионные связи, π - π силы стэкинга и т.д., демонстрируя превосходное взаимодействие с ключевыми аминокислотными остатками. Эти четыре хитовые молекулы могут быть коммерчески закуплены и разработаны в качестве ведущих соединений для ингибиторов EBOV sgP, а также подтверждены в ходе экспериментов по определению лекарственной активности. Следует отметить, что вирус Эбола характеризуется высокой смертностью и высокой трансмиссивностью, и соответствующие требования к биобезопасности являются чрезвычайно строгими. Эксперименты по проверке противовирусной активности должны проводиться в лабораториях с уровнем биобезопасности 4, а в Китае не так много лабораторий с таким уровнем, что ограничивает фундаментальные исследования вируса Эбола. Поэтому результаты данного исследования ограничены ранними стадиями разработки лекарственных препаратов и не содержат экспериментальных данных, таких как проверка противовирусной активности и оценка ADMET. На более поздних этапах необходимо сотрудничать с соответствующими группами вирусологов и использовать профессиональные вирусологические исследовательские платформы для проведения безопасной и эффективной биологической валидации.