Триста палочек, основанных на пути PI3K/AKT/mTOR, способствуют индуцированной липополисахаридом аутофагии и подавляют воспаление в клетках RAW264.7
Липополисахарид (ЛПС) - это эндотоксин, выделяемый грамотрицательными бактериями, который может стимулировать иммунные воспалительные реакции при бактериальной токсичности, вызванной грамотрицательными бактериальными инфекциями в организме человека. Макрофаги часто участвуют в воспалительных реакциях и фагоцитозе, а обработанная ЛПС линия макрофагов RAW 264.7 является широко используемой клеточной моделью для изучения воспалительных реакций иммунных клеток. Аутофагия - это катаболический процесс, в ходе которого цитоплазматическое содержимое переносится аутофагосомами в лизосомы для обширной деградации с целью поддержания клеточного гомеостаза. Аутофагия, как важный клеточный механизм, участвует в возникновении и развитии различных заболеваний, таких как аутоиммунные заболевания, воспалительные заболевания и опухоли. Воспалительная реакция является одним из видов иммунной защиты тканей организма. Умеренная воспалительная реакция помогает восстановить повреждения организма, но чрезмерная воспалительная реакция может привести к неблагоприятным реакциям в организме, вызывая дегенерацию и некроз органов, тканей и клеток, и даже угрожая жизни. Многие исследования выявили двунаправленную связь между аутофагией и воспалением. Умеренная аутофагия может ослабить воспалительный ответ, а чрезмерная аутофагия может усилить воспалительный ответ. Множество иммунных медиаторов могут индуцировать или ингибировать аутофагию, но восстановление ее гомеостаза в значительной степени зависит от аутофагии. Поэтому полное понимание механизма регуляции аутофагии при воспалении может способствовать эффективному лечению воспалительных и аутоиммунных заболеваний.
Триста палочек получают из корня Toddalia asiatica (L.) Lam, растения семейства рутовых (Rutaceae). В "Лечебных записях Туцзя" четко прописаны его свойства: "рассеивает ветер и сырость, способствует циркуляции крови, расслабляет сухожилия, уменьшает отеки и снимает боль". Исследования химического состава показали, что основными химическими компонентами палочки Санбая являются алкалоиды и кумарины. Современные фармакологические исследования подтвердили, что экстракт палочки Санбая обладает противоревматическим, противовоспалительным, противоопухолевым и другими эффектами. Наши предварительные экспериментальные исследования показали, что санбайская палочка может блокировать аутофагию через сигнальный путь фосфатидилинозитол-3-киназа/протеинкиназа B/маммалианский целевой белок рапамицина (PI3K/AKT/mTOR), тем самым подавляя пролиферацию и индуцируя апоптоз клеточной линии фибробластов MH7A. Однако роль спиртового экстракта Toddalia asiatica (TAAE) в аутофагии до сих пор не изучена. Результаты этого исследования показали, что TAAE запускает аутофагию в зависимости от концентрации. Чтобы проверить, играет ли TAAE важную роль в аутофагии макрофагов RAW 264.7 через путь PI3K/AKT/mTOR, в этом эксперименте использовали стимулированные LPS клетки RAW 264.7 в качестве модели для изучения влияния TAAE на аутофагию и иммунную функцию клеток RAW 264.7, а также исследовали молекулярный механизм регуляции TAAE врожденного иммунного ответа.

Макрофаги - одни из важных иммунных клеток в организме человека. Они способны быстро активировать стрессовые состояния против патогенов, вторгающихся в ткани и кровь человека, что приводит к ряду воспалительных реакций. Они являются важными клетками врожденного иммунитета, тесно связанными с возникновением и развитием воспаления. Воспаление - это сложная патологическая реакция, которая обусловлена разнообразными физическими реакциями иммунной системы при воздействии внешней травмы или инфекции. Оно является важной частью патофизиологии многих хронических заболеваний, таких как нейродегенеративные заболевания, ревматоидный артрит, артериосклероз и др. Исследование показало, что ТААЭ может ингибировать Toll-подобный рецептор 4/ядерный фактор - κ B (TLR4/NF - κ B), тем самым снижая экспрессию коллаген-индуцированных воспалительных цитокинов интерлейкина-1 β (IL-1 β) и фактора некроза опухоли - α (TNF - α) в синовии крыс (CIA), подавляя синовит ревматоидного артрита, и подавляя прогрессирование ревматоидного артрита. ТААЭ также может ингибировать ядерный вход NF - κ B, тем самым подавляя высвобождение воспалительных факторов и тормозя пролиферацию синовиальной оболочки. Ян и др. обнаружили, что этаноловый экстракт и этилацетатный экстракт 300 палочек могут подавлять опухание суставов в моделях крыс CIA, снижать уровень провоспалительных факторов, таких как TNF - α, IL-1 β и интерлейкин-6 (IL-6), и увеличивать экспрессию иммуносупрессивного фактора интерлейкина-10 (IL-10) в сыворотке крови. Все вышеперечисленное свидетельствует о превосходном противовоспалительном и противоревматическом действии трехсот палочек.

Аутофагия - это процесс, в котором эукариотические клетки используют лизосомы для деградации собственных цитоплазматических белков и поврежденных органелл под действием генов, связанных с аутофагией. Этот процесс может уничтожать вторгшиеся патогенные микроорганизмы, поврежденные органеллы и аномально накопленные белки, играя важную роль в таких биологических процессах, как контроль качества клеток, метаболизм, а также врожденный и адаптивный иммунитет. Многие исследования подтвердили, что аутофагия оказывает двунаправленное влияние на воспаление: с одной стороны, аутофагия может противодействовать воспалительной реакции, удаляя агрегаты воспалительных белков и снижая уровень провоспалительных цитокинов, вызывающих повреждение тканей; с другой стороны, аутофагия активирует инфламмасомы, производя большое количество воспалительных факторов, тем самым ускоряя воспалительный процесс. После уравновешивания положительных и отрицательных аспектов иммунитета и воспаления аутофагия может рассматриваться как защитник от инфекции, аутоиммунитета и воспаления. Белок легкой цепи 3-II (LC3-II), связанный с микротрубочками, является отличительным белком аутофагии. В процессе аутофагии LC3-I соединяется с молекулой фосфатидилэтанола с помощью комплекса Atg5-Atg12-Atg16 и образует LC3-II. P62 является субстратом для аутофагической деградации, играя решающую роль в распознавании и инкапсуляции деградированных субстратов. Когда Beclin1 сверхэкспрессируется в клетках млекопитающих, он способствует клеточной аутофагии. Таким образом, LC3, Beclin1, P62 и Atg5 могут служить маркерными белками аутофагии. Чтобы выяснить, связан ли противовоспалительный эффект ТААЭ с аутофагией, в данном исследовании использовали Вестерн-блот для определения экспрессии белков P62, Beclin1, Atg5 и LC3, связанных с аутофагией, а также экспрессии белков TNF - α, IL-6 и циклооксигеназы-2 (COX-2), связанных с воспалением. Результаты эксперимента показали, что после воздействия ТААЭ уровень экспрессии белков Beclin1, Atg5 и LC3-II/LC3- постепенно увеличивался, в то время как уровень экспрессии субстратного белка P62 постепенно снижался, а экспрессия белков, связанных с воспалением, также уменьшалась. Экспериментальные результаты с использованием метода MDC для мечения аутофагосом и трансмиссионной электронной микроскопии для наблюдения за аутофагосомами также показали, что ТААЭ способствует аутофагии в клетках RAW 264.7. Для дальнейшей демонстрации влияния аутофагии на воспаление использовали ингибитор аутофагии 3-MA, который также является специфическим ингибитором сигнального пути PI3K, для контроля аутофагии макрофагов, блокирования аутофагического хелирования и деградации белков. Результаты показали, что ингибитор аутофагии 3-MA ослабил ингибирующий эффект ТААЭ на воспалительные цитокины, в то время как вмешательство ТААЭ могло эффективно снизить секрецию цитокинов TNF - α и IL-6 в модели воспаления, еще раз продемонстрировав, что ТААЭ оказывает противовоспалительное действие путем стимулирования аутофагии в клетках RAW 264.7.

Сигнальный путь PI3K/AKT/mTOR играет важную роль в регуляции аутофагии, и уровень аутофагии повышается при ингибировании пути PI3K/AKT/mTOR. MTOR является мишенью рапамицина млекопитающих и играет важную регуляторную роль в реакции аутофагии, выступая в качестве ключевой отрицательной регуляторной оси аутофагии. Было показано, что многие натуральные продукты подавляют воспаление и аутоиммунные заболевания, воздействуя на PI3K/AKT/mTOR-опосредованную аутофагию. Предыдущие эксперименты подтвердили, что TAAE может блокировать аутофагический поток и способствовать апоптозу клеток MH7A через сигнальный путь PI3K/AKT/mTOR. Сигнальный путь PI3K/AKT/mTOR был подтвержден методом вестерн-блоттинга, и экспериментальные данные показали, что ТААЭ значительно снижает уровень экспрессии фосфорилированных PI3K, AKT и mTOR, что указывает на то, что ТААЭ запускает аутофагию путем ингибирования пути PI3K/AKT/mTOR. Одновременное использование агониста PI3K (740Y-P) дополнительно продемонстрировало, что TAAE индуцирует аутофагию путем ингибирования сигнального пути PI3K/AKT/mTOR. Кроме того, сигнальный путь PI3K/AKT/mTOR напрямую связан с воспалением и иммунитетом. В данном исследовании было обнаружено, что обработка ТААЭ снижает уровень провоспалительных цитокинов в LPS-индуцированных клетках RAW 264.7. Данное исследование показывает, что в ЛПС-индуцированной воспалительной среде клеток RAW 264.7 TAAE ингибирует связанный с аутофагией путь PI3K/AKT/mTOR, регулирует связанные с аутофагией белки и факторы воспаления, способствует слиянию и деградации лизосом аутофагосом, влияет на гомеостаз воспалительных клеток, подавляет воспалительные реакции и таким образом оказывает противовоспалительное действие. Результаты данного исследования позволяют предположить, что PI3K/AKT/mTOR является эффективным путем для ТААЭ для оказания противовоспалительного действия и повышения аутофагической активности, что может дать новые идеи для клинического лечения аутоиммунных и метаболических заболеваний, связанных с воспалением, и заслуживает дальнейшего углубленного изучения.