Изучение механизма действия софокарпина при лечении рака простаты на основе клеточных экспериментов in vitro и сетевой фармакологии
Рак предстательной железы (РПЖ) является одной из наиболее распространенных злокачественных опухолей мочевыделительной системы у мужчин среднего и пожилого возраста во всем мире. В 2020 году в мире было зарегистрировано 10,06 млн новых случаев рака у мужчин и 5,53 млн смертей, в том числе 1,41 млн новых случаев РПЖ и 380000 смертей, а соотношение смертности и заболеваемости составило 27%. В Китае было зарегистрировано 120000 новых случаев РПЖ и 50000 смертей, а соотношение смертности и заболеваемости от РПЖ составило 41,7%. Согласно данным исследования Американского онкологического общества, в 2023 году заболеваемость РПЖ займет первое место среди мужских злокачественных опухолей, составив примерно 29%. В настоящее время в клинической практике основными методами лечения РПЖ являются андрогенная депривация, радикальная простатэктомия, лучевая терапия, химиотерапия и молекулярная таргетная терапия. Однако эти методы лечения имеют множество побочных эффектов и склонны к лекарственной устойчивости, что приводит к плохому прогнозу и рецидивам или прогрессированию заболевания у некоторых пациентов. Поэтому поиск новых безопасных и эффективных препаратов для лечения РПЖ имеет большое значение.
Софоридин (SRI) - тетрациклический хинолиновый алкалоид, выделенный главным образом из Sophora alopecuroides L. Исследования показали, что SRI обладает множеством фармакологических эффектов, включая противовоспалительный, противовирусный и противоопухолевый. В 2005 году инъекции гидрохлорида софокарпина были одобрены Государственным управлением по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных средств для клинического лечения злокачественных трофобластических опухолей. В настоящее время SRI опробован в лечении метастазов в печень опухолей желудочно-кишечного тракта. В то же время большое количество отчетов подтвердило, что SRI оказывает хорошее ингибирующее действие на колоректальный рак, рак легких, рак поджелудочной железы и другие опухоли. Однако влияние SRI на PCa и возможный механизм его действия до сих пор неясны.
Сетевая фармакология - это новая дисциплина, основанная на классической фармакологии, биоинформатике и теориях информатики, широко используемая в разработке лекарств и исследовании механизмов их действия. В данной статье исследуется влияние SRI на пролиферацию и апоптоз клеток DU-145 в экспериментах in vitro, а также сочетаются методы сетевой фармакологии и молекулярного докинга для изучения возможного механизма действия, чтобы обеспечить теоретическую основу и данные для клинического лечения PCa с помощью SRI.

РПЖ - наиболее распространенная злокачественная опухоль среди мужчин среднего и пожилого возраста, которая склонна к лекарственной устойчивости и метастазированию, что приводит к плохому прогнозу и высокой частоте рецидивов. Поэтому поиск новых методов терапии для лечения РПЖ стал очень актуальным. Натуральные химические активные ингредиенты традиционной китайской медицины играют важную роль в профилактике и лечении злокачественных опухолей. SRI - это в основном активный алкалоид, выделенный из традиционной китайской медицины Sophora alopecuroides, который обладает различными фармакологическими действиями, среди которых особенно выделяется противоопухолевая активность. В 2005 году софокарпин гидрохлорид для инъекций был одобрен Китайским управлением по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных средств в качестве противоракового препарата. SRI продемонстрировал хорошее противоопухолевое действие на рак желудка, рак печени, рак легких, рак толстой кишки, рак поджелудочной железы и другие опухоли in vivo и in vitro. SRI может ингибировать пролиферацию и инвазию различных опухолевых клеток, способствовать апоптозу и аутофагии раковых клеток. Его функция связана с такими путями, как PI3K/AKT, Wnt/B-catenin, MAPK/ERK и клеточный цикл. В настоящее время роль и точный механизм воздействия SRI на PCa до конца не изучены. В данном исследовании изучается молекулярный механизм терапии РПЖ с помощью клеточных экспериментов in vitro, сетевой фармакологии и методов молекулярного докинга, что создает определенную исследовательскую базу и теоретическую основу для его клинического применения.
Высокая скорость пролиферации является важной характеристикой бесконечного роста клеток злокачественных опухолей, поэтому ингибирование клеточной пролиферации является эффективной стратегией лечения рака. В данном исследовании было обнаружено, что при увеличении концентрации SRI рост клеток DU-145 значительно подавлялся путем определения жизнеспособности клеток и образования клеточных клонов, что указывает на способность SRI ингибировать пролиферацию клеток DU-145. Ядерные белки пролиферирующих клеток Ki67 и PCNA являются маркерными белками клеточной пролиферации и широко используются в качестве прогностических и предсказательных маркеров для диагностики и лечения рака. В данном исследовании была определена экспрессия Ki67 в клетках DU-145 с помощью иммунофлуоресценции и qPCR, и было установлено, что SRI может значительно подавлять экспрессию Ki67. qPCR и Вестерн-блот анализ показали, что SRI может значительно снизить экспрессию PCNA в клетках DU-145, что еще раз доказывает, что SRI обладает способностью подавлять пролиферацию клеток DU-145.
Апоптоз является основной причиной гибели опухолевых клеток, поэтому избегание апоптоза может привести к резистентности при лечении опухолей. Bcl-2, являясь ингибитором апоптоза, играет решающую роль в регуляции апоптоза клеток. Bax является гомологичным конъюгатом Bcl-2 и проапоптотическим белком. Соотношение Bcl-2 и Bax является важным показателем для измерения эффекта клеточного апоптоза. Каспаза-3 и каспаза-7 являются исполнителями клеточного апоптоза. Когда происходит апоптоз, каспаза-3 и каспаза-7 последовательно расщепляются и активируются вышележащими белками каспазами. Затем активированные каспаза-3 и каспаза-7 расщепляют множество субстратов, расположенных ниже по течению, что в конечном итоге запускает реакцию апоптотического каскада. В данном исследовании апоптоз клеток DU-145 после 48 часов лечения SRI определялся с помощью проточной цитометрии, и результаты показали, что SRI может значительно способствовать апоптозу клеток DU-145. Поэтому мы дополнительно изучили экспрессию факторов, связанных с апоптозом. Результаты qPCR показали, что SRI может повышать экспрессию мРНК каспазы-3 и каспазы-7, снижать экспрессию мРНК Bcl-2 и уровень экспрессии мРНК Bax, а соотношение Bcl-2/Bax значительно снижается (P<0,05). Кроме того, результаты вестерн-блоттинга показали, что SRI может повышать экспрессию белка clean-Caspase-3 и понижать экспрессию белка Bcl-2. Несмотря на отсутствие существенной разницы в повышении экспрессии белка Bax, соотношение экспрессии белков Bcl-2/Bax было значительно снижено (P<0,05). Эти результаты свидетельствуют о том, что SRI может регулировать экспрессию факторов, связанных с апоптозом, активировать сигнальные пути апоптоза и индуцировать апоптоз в клетках DU-145.
Кроме того, чтобы изучить механизм влияния SRI на пролиферацию и апоптоз клеток DU-145, в данном исследовании мы проанализировали его с помощью методов сетевой фармакологии. Мы собрали 127 мишеней SRI в базах данных HERB, TCMSP, Pharm Mapper и Swiss Target Prediction, а также получили 60 общих мишеней SRI, действующих на PCa, с помощью онлайн-инструмента Venny 2.1.0. С помощью анализа сети PPI мы определили 16 основных целей (10 лучших значений степени), включая ALB, TNF, IL6, CASP3, MAPK1, PPARG, MDM2, PGR, MAPK8, NR3C1, ABL1, MAPK14, PARP1, HDAC2, CDK2, GSK3B и др. MAPK8, CASP3, MAPK1, MAPK14 и основные мишени TNF включены в сигнальный путь MAPK. Анализ GO обогащения дал 158 позиций (P<0,01), указывающих на то, что SRI может оказывать терапевтическое воздействие на PCa в основном за счет регуляции экспрессии генов, процесса апоптоза, фосфорилирования белков и активности серин/треонин/тирозин киназ. Результаты анализа обогащения KEGG-путей показали наличие 84 сигнальных путей, включая сигнальный путь рака, протеогликаны в раке, сигнальный путь MAPK, реактивные виды кислорода в хемоканцерогенезе, сигнальный путь PI3K-AKT, апоптоз и т.д. (P<0,01). Наиболее интересным аспектом является роль сигнального пути MAPK в противораковом процессе SRI. Митоген-активированная протеинкиназа (MAPK) может передавать внеклеточную информацию в ядро и играет важную роль в физиологических и патологических процессах. В клетках млекопитающих существует три типа киназ семейства MAPK: киназа, регулируемая внеклеточным сигналом (ERK), c-JunN-концевая протеинкиназа/протеинкиназа, активируемая стрессом (JNK/SAPK), и p38 митоген-активируемая протеинкиназа (p38MAPK, также известная как MAPK14).
P38MAPK - это активированная протеинкиназа, которая участвует в многочисленных биологических процессах, таких как пролиферация, дифференцировка и апоптоз клеток. Ее активация может подавлять пролиферацию клеток и способствовать апоптозу. Исследования показали, что активация p38-пути может снижать пролиферативную активность клеток рака желудка BGC-823 и блокировать их в фазе G2/M. Активация p38MAPK может подавлять пролиферацию клеток SMMC-7721 и запускать внутриклеточный сигнальный каскад Caspase, в конечном итоге вызывая апоптоз. Кроме того, исследования показали, что экстракты традиционной китайской медицины могут активировать p38MAPK, запускать реакции апоптотического каскада, опосредованные Caspase, и индуцировать апоптоз в клетках рака легких Lewis, а также в клетках рака полости рта HSC-3 и SCC-9. Киназа P38MAPK также играет важную роль в возникновении и развитии ПКа. Исследования показали, что активация p38MAPK может противостоять пролиферации клеток, способствовать апоптозу и вызывать состояние покоя опухоли при злокачественной трансформации эпителия простаты или метастатическом раке простаты в костях. Между тем, другие исследования показали, что такие компоненты, как доцетаксел и урсоловая кислота, могут повышать уровень фосфорилирования p38MAPK, вызывать старение клеток PCa, подавлять пролиферацию различных клеток PCa, таких как PC-3 и 22Rv1, и способствовать их апоптозу. Поэтому данное исследование посвящено изучению роли протеинкиназы p38MAPK в борьбе с ПКа с помощью SRI. Используя технологию молекулярного докинга для проверки связывания SRI с белком p38MAPK, результаты показали, что SRI может стабильно связываться с белком p38MAPK, с энергией связывания -6,83 ккал/моль. Результаты определения уровня экспрессии p-p38MAPK и белка p38MAPK указывают на то, что SRI может активировать белок p38MAPK, а уровень фосфорилирования белка p38MAPK повышается, что позволяет предположить, что SRI может оказывать анти-PCa эффект путем активации белка p38MAPK и индуцирования пути апоптоза.
Таким образом, SRI может подавлять пролиферацию клеток DU-145 и способствовать их апоптозу, что может быть связано с активацией p38MAPK. Однако в данном исследовании изучалось только влияние SRI на клетки DU-145 in vitro. Следующим шагом станет проведение экспериментов на животных in vivo для дальнейшего изучения механизма противоракового действия SRI.