Изучение механизма действия препарата Гуанганькао Дин в лечении кастрационно-резистентного рака простаты на основе сетевой фармакологии и экспериментальной проверки
Рак предстательной железы (РПЖ) - наиболее распространенная злокачественная опухоль репродуктивной системы пожилых мужчин. Многие ранние методы лечения с лишением андрогенов эффективны, но большинство из них в конечном итоге прогрессируют от гормоночувствительного рака простаты до кастрационно-резистентного рака простаты (КРРП). CRPC - это инвазивный рак простаты с высокой летальностью. Более чем у 84% пациентов с CRPC обнаруживаются метастазы, а медиана выживаемости составляет всего 20 месяцев. Хотя в последние годы появились новые химиотерапевтические и эндокринные препараты, они имеют множество побочных эффектов, а у эндокринных препаратов есть проблемы с резистентностью, что сокращает время действия препарата. Поэтому поиск новых препаратов имеет большое значение для замедления процесса кастрационной резистентности и лечения КРРС.
Глабридин - это флавоноидное соединение, выделенное из солодки, которое обладает широким спектром биологической активности, такой как противовоспалительная, антиоксидантная, противоопухолевая, нейропротекторная и противоостеопорозная. Сообщается, что глицирризин хорошо подавляет пролиферацию опухолевых клеток и индуцирует апоптоз при раке молочной железы, раке печени, раке желудка и раке шейки матки. Однако молекулярный механизм воздействия глицирризина на CRPC до конца не изучен. Сетевая фармакология - это сочетание фармакологии, информатики и информационных сетей на основе системной биологии, дающее новые идеи для открытия и выбора лекарств при сложных заболеваниях. Для дальнейшего изучения механизма действия Гуанганькао Дин на КРПК мы использовали сетевую фармакологию, молекулярный докинг и клеточные эксперименты, чтобы исследовать механизм его действия, предоставляя рекомендации для будущих фундаментальных исследований и клинического применения лекарств.

В последние годы достигнут значительный прогресс в лечении рака предстательной железы с помощью традиционной китайской медицины, особенно в лечении РПЖ. Сочетание традиционной китайской медицины с хирургическим вмешательством или химиотерапией позволяет уменьшить размер опухоли, снизить уровень ПСА, уменьшить количество рецидивов и продлить время выживания. Многие исследования показывают, что активные ингредиенты солодки оказывают значительное противоопухолевое действие на КРРС. Gioti et al. обнаружили, что экстракт солодки (GGE) отдельно или в комбинации с доксорубицином оказывает антипролиферативное действие на андрогеннезависимые клетки рака простаты (клетки PC-3) и может способствовать экспрессии генов, связанных с аутофагией, таких как LC3A, ULK1 и AMBRA1. Чжан и др. обнаружили, что изоликвиритигенин может ингибировать пролиферацию клеток рака простаты (PC-3 и 22RV1), вызывать апоптоз, блокировать G2/M клеточный цикл и подавлять рост ксенотрансплантатов PC-3 в экспериментах на животных in vivo. Солодка проявляет отличную активность против КРРС, а глицирризин в солодке - один из многих флавоноидов, привлекающих большое внимание и обладающих хорошей противоопухолевой активностью. Механизм действия на КРПК заслуживает дальнейшего изучения.
По сравнению с традиционной фармакологией, сетевая фармакология открывает новые перспективы для разработки новых лекарств. Чтобы лучше понять механизм действия глицирризина на CRPC, мы использовали методы сетевой фармакологии для сбора 683 целей глицирризина через базы данных, такие как TCMIO, TCMSP и PharmMapper. Мы получили 55 ключевых мишеней глицирризина для кастрационно-резистентного рака простаты с помощью диаграммы Венна и определили 10 основных мишеней, таких как AKT1, TP53, ESR1, EGFR и ALB с помощью анализа сети взаимодействия белков PPI. Анализ обогащения GO показал, что глицирризин в основном регулирует клеточный метаболизм и апоптоз, регулируя фосфорилирование белков, реакции окисления и клеточный цикл. Молекулярный докинг показал, что глицирризин обладает хорошей стыковочной активностью с 10 основными мишенями. Предполагается, что глицирризин может оказывать противоопухолевое действие, регулируя экспрессию этих основных белков-мишеней. Среди этих основных мишеней наибольшей стыковочной активностью обладает белок AKT1. AKT1 является одним из важных регуляторных факторов в сигнальном пути PI3K/AKT, вовлеченным в различные биологические процессы опухолей. При раке простаты генетические вариации и дисрегуляция экспрессии генов компонентов PI3K/AKT-пути были обнаружены в 42% образцах первичного рака простаты и 100% образцах метастатического рака простаты на основании геномных и транскриптомных профилей. В ранних исследованиях было высказано предположение, что подтипы AKT (AKT1, AKT2) могут способствовать переходу рака простаты из андрогенчувствительной стадии в гормонорефрактерную. На основе фундаментальных исследований по лечению пациентов с ХРПН были получены данные о том, что нокаут AKT1/2 в животных моделях кастрационно-резистентного рака простаты значительно уменьшает метастазы in vivo и in vitro. Можно предположить, что подавление экспрессии AKT1 может улучшить прогноз выживаемости пациентов с КРРП, а ингибиторы AKT1 могут стать потенциальным средством лечения пациентов с КРРП. Наше исследование теоретически предполагает, что глицирризин может быть ингибитором AKT1, но может ли глицирризин стать эффективным ингибитором AKT1 для больных КРРС, еще требует дальнейшей экспериментальной проверки в будущем.
Результаты обогащения KEGG-путей показали, что сигнальный путь PI3K/AKT и протеогликаны вовлечены в 105 родственных сигнальных путей, включая рак, рак простаты, активацию хемокиновых рецепторов, эндокринную резистентность и устойчивость к ингибиторам тирозинкиназы рецепторов эпидермального фактора роста (P<0,01). Среди них наиболее значимым является фосфатидил-3-киназный (PI3K)/серин-треониновый протеинкиназный (AKT) сигнальный путь. Сигнальный путь PI3K/AKT участвует в регуляции клеточного метаболизма, роста, пролиферации, дифференцировки и синтеза белка. Мутации в сигнальном пути PI3K/AKT были обнаружены во многих опухолях человека. Данные исследований показывают, что до 70% - 100% пациентов с распространенным раком простаты испытывают дисрегуляцию PI3K-пути. Также было установлено, что сигнальный путь PI3K/AKT играет важную роль в прогрессии гормоночувствительного рака простаты в кастрационно-резистентный рак простаты, а механизм его действия может быть связан с регуляцией сигнального пути рецептора андрогена (AR), что может служить потенциальным биомаркером для CRPC. В настоящее время ингибиторы, связанные с сигнальным путем PI3K/AKT, такие как AZD5363, вышли на стадию клинических испытаний и достигли значительного терапевтического эффекта. Изучение ингибиторов, связанных с этим путем, имеет большое значение для лечения КРРС.
Далее методом CCK8 мы обнаружили, что глицирризин может значительно подавлять пролиферацию клеток PC-3. Проточная цитометрия и окрашивание DAPI показали, что он может вызывать апоптоз клеток, а под микроскопом наблюдалось уменьшение их количества и морфологическое уменьшение. При скрининге концентраций противоопухолевых препаратов мы обнаружили, что их IC50 несколько выше, что связано с полугибким методом докинга, используемым для молекулярного докинга. По сравнению с гибким докингом, энергия связывания, рассчитанная с помощью полугибкого докинга, ниже. Кроме того, глицирризин, являясь природным антиоксидантом, обладает сильным антиоксидантным действием. Однако в противоопухолевых экспериментах природные антиоксиданты в малых дозах не показали хорошей противоопухолевой активности, а природные антиоксиданты в больших дозах оказывают токсическое воздействие на клетки, и их конкретный механизм нуждается в дальнейшем изучении. Основываясь на сигнальных путях KEGG, предсказанных сетевой фармакологией, мы предполагаем, что ингибирующий эффект глицирризина на клетки PC-3 может быть связан в основном с сигнальным путем PI3K/AKT. Для изучения влияния глицирризина на экспрессию белков, связанных с сигнальным путем PI3K/AKT, в клетках PC-3 были проведены вестерн-блоттинговые эксперименты. Результаты показали, что глицирризин может значительно ингибировать процесс фосфорилирования белков AKT. В нашем эксперименте было замечено, что глицирризин может значительно подавлять экспрессию фосфорилированного белка AKT, но ингибирующий эффект на экспрессию фосфорилированного белка PI3K не соответствовал ожиданиям. После многократной регулировки концентрации и соотношения загрузки белка и строгой стандартизации операции, белок все равно не показал значительного эффекта. Предполагается, что причина может быть связана с проблемой качества самого белка p-PI3K, который обладает низкой потенцией. Однако из-за ограниченного финансирования данного исследования мы не стали заменять белки другими продуктами. В будущих экспериментах мы проанализируем больше родственных белков этого пути, чтобы проверить нашу гипотезу.
Таким образом, в данном исследовании с помощью сетевой фармакологии был проанализирован и предсказан потенциальный механизм действия глицирризина на кастрационно-резистентный рак простаты, а также проведена его проверка с помощью молекулярного докинга и экспериментов на клетках in vitro. Результаты показали, что глицирризин может ингибировать пролиферацию и индуцировать апоптоз клеток PC-3, а механизм его действия связан с процессом фосфорилирования белка AKT. Таким образом, мы предполагаем, что механизм его действия против КРРС может в основном заключаться в регулировании фосфорилирования белков, связанных с сигнальным путем PI3K/AKT. Данное исследование не только предлагает идеи для изучения молекулярного механизма действия Guanggancao Ding в лечении кастрационно-резистентного рака простаты, но и предлагает эффективный метод для разработки и клинического применения противоопухолевых препаратов, содержащих флавоноиды в солодке.